بروتوكول لتشكيل بيوفيلم الملون في جهاز ميكروفلويديك مع مايكرو الأركان

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات تكوين اللافتات البكتيرية في جهاز ميكروفيليديك مع أعمدة دقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي زراعة البكتيريا المختبرة ، وفي هذه الحالة مضان pseudomonas.

تتمثل الخطوات النهائية في تجميع الإعداد التجريبي ، وحقن البكتيريا في شريحة الموائع الدقيقة ، وجمع البيانات. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج التطور الزمني للقائمين بالبث من خلال صور الفحص المجهري الفلوري للأنفلونزا. يعد العرض المرئي لهذا المعدن أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الخطوات المختلفة.

بسبب الطبيعة متعددة التخصصات للتجربة ، يتطلب هذا الإجراء رقائق السيليكون مع نقش أيوني عميق التفاعل. يجب غسل مقاومة الضوء على الرقائق. ابدأ بصمت القالب الرئيسي.

أضف قطرتين أو ثلاث قطرات من ثلاثي كلورو إيثيلين إلى قارورة وضعها في مادة مجففة مع تصميم القالب لأعلى بجانبها. في غضون ساعتين أو ثلاث ساعات ، سيتم عزل القالب. أثناء العزلة ، قم بإعداد قاعدة سيليكون مزيج PDMS 1 8 4 مع عامل معالجة بنسبة 10 إلى واحد.

ثم قم بإزالة PDMS تحت فراغ لمدة ساعتين تقريبا. الآن انقل رقاقة منعزلة إلى حامل واسكب PDMS فوقها ، مع ضمان عدم تكوين فقاعات. اسمح ل PDMS بالمعالجة على الرقاقة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين.

هذا يصنع ختم A-P-D-M-S من قالب السيليكون الحجم. عند اكتمال المعالجة ، انزع ختم PDMS بمساعدة القاطع. ثم قم بقص الختم إلى شريحة ميكروفلويد باستخدام القاطع.

الآن ، باستخدام قلب القطع ، قم بحفر الثقوب عند المدخل والبقاء على قيد الحياة على الختم. الخطوة التالية هي ربط الختم بالزجاج. كشف زلة غطاء 24 ملم وختم PDMS لبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية.

بعد التعريض الضوئي ، قم بتوصيل زلة الغطاء بالجانب السفلي من ختم PDMS وستتشكل رابطة. ضع التجميع في فرن 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لإكمال عملية هذا البروتوكول ، قم بإعداد ألواح LB مصنوعة من ماء فائق النقاء ومزودة بجرعات 50 ميكروغراما لكل مليلتر من التتراسيكلين مضافا عند 50 إلى 55 درجة مئوية.

عند صب الأطباق ، يمكن أن تنفجر الفقاعات عن طريق إشعالها. يجب تأريخ الألواح المبردة والصلبة وتخزينها عند أربع درجات مئوية في غلاف من ورق القصدير. أعدت أيضا مرق LB المصنوع من ماء نقي للغاية ومغطى بجرعة 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من التتراسيكلين.

قم بتخزين المرق على أربع درجات مئوية وملفوفه أيضا بورق الألمنيوم. الآن مخزون استزراع من مضان pseudomonas المخزنة عند سالب 80 درجة مئوية على ألواح LB ، وقم بربط الصفائح بنمط متعرج واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية في الظلام. في اليوم التالي ، اختر مستعمرة من الطبق وقم بتلقيح قارورة من S one المحضرة حديثا محتضنة طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة من الاهتزاز.

قياس الكثافة البصرية للثقافة بعد الحضانة. ثم اصنع الحل S اثنين. أضف خمسة ملليلتر من LB إلى أنبوب بلاستيكي ، ثم أضف ما يكفي من محلول S واحد ل OD عند 600 نانومتر من 0.1 ، وهو أمر نموذجي لتجربة الأغشية الحيوية.

أولا ، قم بإعداد التجربة باستخدام ملاقط قم بتوصيل الأنابيب البلاستيكية بقطر داخلي يبلغ 0.20 بوصة بمداخل ومخارج الشريحة المعدة. يجب أن تكون الأنابيب مرنة وطويلة بما فيه الكفاية. ها هم حوالي 20 بوصة.

ثم املأ المحاقن بالمحلول S two. قم بإرفاق 30 إبر ضعيفة وإزالة الفقاعات. يعد منع فقاعات الهواء من دخول القناة خطوة حاسمة ، خاصة بسبب مدة الخط للتجربة.

يمكن أن تلحق الفقاعات الضرر بالهياكل اللينة التي تشكلها البكتيريا. ثم قم بتوصيل المحاقن بأنابيب المدخل وقم بتوصيل أنابيب المخرج بحاويات النفايات. الآن ضع المحاقن في مضخة حقنة واضبط المضخة على معدل التدفق المطلوب ، مثل ثمانية ميكرولتر في الساعة على مجهر مجهز بغرفة خلية مضبوطة على درجة حرارة الحضانة.

استخدم هدف 40 × ربما لعرض شريحة الموائع الدقيقة. الآن ، ابدأ المضخة. عندما يتم إدخال البكتيريا إلى الغرفة ، يبدأ تكوين الأغشية الحيوية أيضا.

سوف يتشكل الأغشية الحيوية وينضج لساعات وأيام ، ويلتقط صورا لتتبع تقدمه. باستخدام شريحة الموائع الدقيقة المصنعة SEMA. يتم إنشاء مدخل يشبه الشوكة لمعادلة رأس الضغط عبر الجهاز.

يمكن أيضا ملاحظة أن جدران الأعمدة عمودية تقريبا. لفحص تكوين الأغشية الحيوية ، تم حقن مضان pf في الجهاز بمعدل ثمانية ميكرولتر في الساعة. بدأ تكوين الأغشية الحيوية بعد بضع دقائق من ضخ الثقافة البكتيرية المخففة.

ومع ذلك ، بعد بضع ساعات لوحظ ظهور هياكل خيوطية تمتد بين الأعمدة الدقيقة بالقرب من القسم الأوسط. يحدد القطع الناقص المتقطع لافتات البث المكونة متشكلة مربوطة في أحد طرفيها بمنطقة القطب لأحد الأعمدة الدقيقة. شوهدت اللافتات أيضا على طول القطر بين عمودين صغيرين.

زاد سمك اللافتات بمرور الوقت بسبب انقسام الخلايا ، وكذلك دمج البكتيريا العوالق. كما أنها تكاثرت مع احتلال اللافتات الزمنية التي تشغل حجما كبيرا في الجهاز مما أدى إلى تكوين غشاء حيوي ناضج ، والذي يمكن أن يسد الجهاز. تظهر المحاكاة الميكانيكية للتدفق عبر الجهاز أن اللافتات توجه نفسها في البداية على طول خطوط انسيابية السوائل.

علاوة على ذلك ، في المرحلة الأولية ، تنشأ اللافتات في مواقع ذات أعلى سرعة تدفق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشكل اللافتات الحيوية وتطورها في بيئة الموائع الدقيقة. لا تنس أن العمل مع البكتيريا يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل بروتوكولات السلامة الحيوية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.