تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خريطة للتفاعل بين بروتينين أو مجالين بروتينيين. في هذه الحالة ، لا تزال مجالات البروتين المتعلقة بالسرطان و CHFR قيد الدراسة. الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خريطة للتفاعل بين بروتينين أو مجالين بروتينيين.

في هذه الحالة ، لا تزال مجالات البروتين المتعلقة بالسرطان و CHFR قيد الدراسة. الخطوة الثانية هي احتضان مصفوفة الببتيد CHFR مع شريكها الملزم ، البروتين الساكن. بعد ذلك ، يتم غسل المصفوفة وتحضنها ببيروكسيداز فجل الحصان ، وهو جسم مضاد مترافق.

ثم تخضع المصفوفة للكشف عن التلألؤ الكيميائي للكشف عن الارتباط. الخطوة الأخيرة هي تحليل النتائج وتحديد مواقع الارتباط بين البروتينات. تمهد هذه الدراسة الطريق لتصميم مثبطات عقلانية لربط CHFR الذي لا يزال ، والذي يمكن أن يؤدي تفاعله غير المنضبط إلى تطور السرطان.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحث عن تفاعل البروتين ، مثل ما هي المناطق المحددة التي تتأمل تفاعل بين بروتينين ، قسم تسلسل البروتين المستهدف إلى 10 إلى 20 ببتيدا متبقايا. هذا التداخل جزئيا. يمكن أن يتنوع مقدار التداخل ، ولكن من حيث المبدأ ، كلما طالت مدة التداخل ، كان ذلك أفضل.

عند تصميم الببتيدات ، تأخذ في الاعتبار عناصر الهيكل الثانوي المعروفة في البروتين والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن التفاعل. يمكن طلب مجموعة الببتيد المصممة من خلال البائعين التجاريين. بالنسبة لهذه التجربة ، ترتبط الببتيدات من بقايا مجال CHFR من 4 24 إلى 6 62 تساهميا بالمصفوفة من خلال الطرف C.

بعد استلام المصفوفة المصممة ، قم بإعدادها للتجربة عن طريق حظرها أولا لمنع الارتباط غير المحدد. اصنع محلول حجب بوزن 2.5٪ لكل حجم. مسحوق الحليب الخالي من الدسم في محلول عازلة تريس يحتوي على 0.05٪ Tween 20 أو TBST لمنع الارتباط غير المحدد.

اغمر المصفوفة في خمسة ملليلتر من محلول الحظر. احتضن المصفوفة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على شاكر. اغسل المصفوفة أولا بخمسة ملليلتر من محلول المنع لمدة 30 ثانية.

ثم اغسل المصفوفة مرتين بخمسة ملليلتر من TBST لمدة خمس دقائق على شاكر في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان المصفوفة المغسولة بخمسة ملليلتر من محلول البروتين الموسوم ب poly histidine الذي يحتوي على 2.5٪ من الوزن لكل حجم. مسحوق الحليب الخالي من الدسم لمنع الارتباط غير المحدد.

هنا ، يتم استخدام محلول 4.5 ميكرومولار من بقايا البروتين الساكنة من 500 إلى ستة 50. ثم احتضان المصفوفة في محلول البروتين لمدة ثلاث إلى ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة في محلول البروتين.

اغسل المصفوفة بخمسة ملليلتر من TBST لمدة 30 ثانية على شاكر في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسلتين إضافيتين لمدة خمس دقائق. الآن احتضان المصفوفة المغسولة بخمسة ملليلتر من الجسم المضاد المترافق لفجل الحصان المخفف بيروكسيداز في مخزن حضانة يحتوي على نفس المكونات بنفس تركيزات محلول الحجب لمدة ساعة واحدة على شاكر في درجة حرارة الغرفة ، يمكن للجسم المضاد ربط البروتين المستهدف أو العلامة ، وإجراء تجارب التحكم ، واختبار تفاعل الجسم المضاد مع الببتيدات على المصفوفة عن طريق تكرار نفس البروتوكول على مصفوفة منفصلة انزلق دون احتضان البروتين قبل قراءة المصفوفات. اغسلها كما كان من قبل بخمسة ملليلتر من TBST.

قم بإجراء تطوير التلألؤ الكيميائي باستخدام مجموعة ركيزة النشاف الغربي المحسنة للتلألؤ الكيميائي. قم بإجراء الكشف باستخدام محلل صور مضيء مثل كاميرا Fuji film LAS 3000. قم بتحليل النتائج ، وتأكد من أن كلا التكرارين على المصفوفة يظهران نفس الإشارات بحيث تكون النتائج موثوقة.

إذا كان هيكل شريك البروتين معروفا ، فابحث في هيكل الببتيدات الملزمة وابحث عن مواقع الربط. ضع في اعتبارك أن الببتيدات البعيدة في التسلسل يمكن أن تكون معا في الهيكل الثلاثي وتنشئ موقعا ملبطا. في مثالنا ، لا يزال بروتين Centro Somal مهما للغاية يتحكم في الانقسام الطبيعي للخلايا ولا يزال تكاثر الخلايا يتفاعل مع العديد من البروتينات من خلال منطقته المضطربة جوهريا.

باستخدام مجموعة الببتيد المصممة ، تم الكشف عن المواقع التي لا تزال ملزمة في مثبط الورم CHFR. تمثل كل بقعة سوداء في المصفوفة الببتيد المشتق من A-C-H-F-R والذي لا يزال يلاحظ أن كل ببتيد يظهر مرتين نظرا لوجوده في نسختين ، مما يتحقق من موثوقية النتائج. كشف فحص مصفوفة الببتيد عن سبعة ببتيدات مشتقة من CHFR ترتبط ببقايا المنطقة التي لا تزال مضطربة جوهريا من 500 إلى ستة 50.

سمحت لنا هذه النتائج بتعيين موقع الربط الذي لا يزال على CHFR. على الرغم من مسافة هذه الببتيدات السبعة على التسلسل الأولي ل CHFR. إنها تخلق موقعا ملزما محددا جيدا لا يزال في هيكل CHFR الثلاثي.

هذه الطريقة قابلة للتطبيق لتوصيف كل تفاعل بروتين بروتين باتباع هذا الإجراء. يجب استخدام طرق كمية مثل التألق والنظائر أو ITC من أجل التحقق من إدخال الببتيد في التحديد الكمي.