فك رموز محواري مقررات تمهيدية للمجموعات المحددة وراثيا من الخلايا العصبية في الأنبوبة العصبية الاستفادة الفرخ في البيضة Electroporation

مرحباً، أنا هام من مختبر الدكتور ريفيو كلار في قسم البيولوجيا العصبية الطبية في الجامعة العبرية في القدس. ومرحباً، أنا صوفي إسمان وأنا أيضاً من مختبر لارس. سنعرض لكم اليوم إجراءً للترحيل الكهربائي في الجسم الحي (in vivo electroporation) وتحضير النخاع الشوكي بطريقة الكتاب المفتوح.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مسارات المحاور العصبية لمجتمعات عصبونية محددة وراثياً في الحبل الشوكي للجنين. لذا، فلنبدأ. لبدء هذا الإجراء، انقل بيض دجاج "ليغهورن" الأبيض المخصب من درجة حرارة الغرفة إلى حاضنة مرطبة، ويفضل أن تكون مزودة بصوانٍ متأرجحة عند درجة حرارة 37 إلى 38 °C.

من المهم مراقبة درجة الحرارة والرطوبة في الحاضنة من أجل الحصول على أجنة قابلة للحياة ومتزامنة. يتم إجراء التثقيب الكهربائي لأجنة الدجاج عندما تصل إلى مرحلة hamburger and Hamilton أو HH stage 18 to 20، وهي المرحلة المثلى للتعبير النوعي المعتمد على المعزز. في هذه المرحلة، يكون الرأس بزاوية قائمة بالنسبة للجذع.

كذلك في المرحلة 18 إلى 20 من مراحل هامبرجر-هاميلتون (HH)، يجب أن تظهر مجموعة واسعة من الأوعية الدموية خارج الجنينية، مثل الأوعية الحيوية الأمامية والخلفية اليمنى واليسرى. تصل أجنّة الدجاج إلى المرحلة 19 إلى 20 من مراحل HH بعد 66 ساعة من الحضنة، وفي ذلك الوقت يتم إخراج البيض من الحاضنة. بعد إخراج البيض، يوضع بشكل أفقي ويترك لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق؛ حيث يكون الجنين حينئذٍ متمركزاً في القطب العلوي للبيضة.

قبل إجراء التثقيب الكهربائي، يتم تحضير محلول هانك (Hank's solution) مع إضافة 100 units/mL من البنسلين و0.1 mg/mL من الستربتومايسين. يتم تحضير خليط الحمض النووي (DNA) المطلوب بتركيز يتراوح من 2 إلى 5 µg/µL، مع إضافة بضع حبيبات من صبغة الفاست جرين (fast green) لتسهيل رؤية الـ DNA المحقون. كما يجب تجهيز ماصة فموية، وإبرة حقنة معقمة، ومقص صغير، وشريط لاصق.

قم بتحضير الشعيرات الدقيقة عن طريق سحب شعيرات زجاجية بقطر 0.5 millimeter باستخدام جهاز سحب الماصات. ضع أقطاب التنجستن في أجهزة التحكم الدقيقة وقم بتوصيل الأقطاب بمولد النبضات. اضبط الجهد في مولد النبضات على minus 30 volts، وطول كل نبضة على 50 milliseconds، وعدد النبضات على ثلاث نبضات.

انتقل إلى عملية التثقيب الكهربائي قبل كشف الأجنة والتعامل معها. أدخل سرنجة عند القطب الضيق للبيضة واسحب من خمسة إلى ستة ملليلتر من الألبومين من كل بيضة. يتم إزالة الألبومين لتجنب انسكابه.

عند القص في الخطوة التالية، استخدم المقص الصغير للقص. افتح نافذة بيضاوية في الجانب العلوي من البيضة بعد الكشف عن جنين الدجاج، ثم قم بترطيبها باستخدام 0.5 إلى 1 mL من محلول hanks وpenicillin streptomycin. بعد ذلك، استخدم ماصة فموية لتحميل الشعيرة الزجاجية الدقيقة.

باستخدام مزيج صبغة DNA، يجب أن يتم تحميل الشعيرة الدقيقة ذات القطر المناسب بـ DNA بسهولة. تحت المجهر ثنائي العينين، حدد موقع الجنين لحقن DNA في الأنبوب العصبي. ضع الجنين بحيث يكون ذيله متجهاً نحوك.

في هذه المرحلة النمائية، يكون الحبل الشوكي مرئياً بوضوح، وبالتالي لا توجد حاجة إلى تقنيات تباين. يكون الحبل الشوكي مغلقاً عند الطرفين الرأسي والذيلي. ومع ذلك، عند إجراء ثقوب بالأنابيب الشعرية الدقيقة، يتم عمل ثقوب أكثر في الأنبوب العصبي واختراقه بزاوية ضحلة؛ حيث يجب أن يخترق الأنبوب الشعري الدقيق، الذي يتميز بكونه رفيعاً بما يكفي وبقطر مناسب، الأنبوب دون إتلافه.

قم بحقن الـ DNA باستخدام أداة نفخ يدوية. يجب أن تطلق الشعيرة المجهرية ذات القطر المناسب الـ DNA عن طريق زفير منتظم. يجب أن ينتشر الصبغ الأخضر من طرف الذيل وصولاً إلى حويصلات الدماغ النامي.

قم بالحقن حتى يمتلئ الأنبوب العصبي؛ حيث يلزم إجراء التثقيب الكهربائي للحمض النووي (DNA electroporation) لتمكين الحمض النووي المحقون من دخول الخلايا أولاً. ضع الأقطاب الكهربائية بشكل موازٍ للأنبوب العصبي وبأقرب مسافة ممكنة منه دون ملامسة الأنبوب نفسه. تأكد من أن الأقطاب الكهربائية مغطاة بالسائل للسماح بالتوصيل الكهربائي أثناء النبضة.

عادةً ما يكون محلول Hank الذي تمت إضافته فور كشف الجنين كافياً. ولكن إذا لم يكن كذلك، يتم إضافة قطرة واحدة من محلول Hank مباشرة قبل النبضة مع وضع الأقطاب الكهربائية وغمرها في السائل لإجراء التثقيب الكهربائي، ثم تُزال الأقطاب الكهربائية بعناية ويُغلق النافذة والبيضة باستخدام شريط لاصق. ومن المهم إغلاق البيضة تماماً لمنع جفاف الجنين خلال فترة الحضانة التالية.

أعد البيضة إلى الحاضنة واتركها حتى يصل جنين الدجاج إلى اليوم السادس من التطور الجنيني (E6). وعندما يحين وقت التصوير، أي في اليوم السادس (E6) بعد ثلاثة أيام من عملية التثقيب الكهربائي، قم بإخراج الجنين من البيضة ووضعه في طبق بتري مغطى بالسيليكون ويحتوي على PBS باستخدام مقص دقيق.

قم بقص الأغشية ومد الجنين من جانبه البطني باستخدام دبابيس تثبت في السيليكون لإبقائه في مكانه. وباستخدام شعيرة مجهرية حادة من التنجستن، قم بإجراء شق طولي على طول الصفيحة السقفية من الدماغ الخلفي نزولاً إلى الذيل.

قم بعمل شقين طوليين إضافيين على كلا جانبي الحبل الشوكي، لفصل عقد الجذر الظهري أو DRGs عن الحبل الشوكي. افصل الصفيحة الأرضية عن النسيج بدءاً من الذيل وصولاً إلى الدماغ الخلفي، مع ترك الحبل الشوكي سليماً. وأخيراً، استخدم مقصاً دقيقاً لقطع الحبل الشوكي في مقطع عرضي عند الدماغ الخلفي وفصل الحبل الشوكي عن الجسم.

الآن وبعد عزل الحبل الشوكي، قم بفردة في طبق بتري جديد مطلي بالسيليكون يحتوي على PBS، مع استخدام دبابيس لتثبيته من الدماغ الخلفي وصولاً إلى الذيل لإنتاج تحضير تثبيت مسطح. قم بتثبيت الحبل الشوكي في 4%paraldehyde في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بإجراء الصبغ المناعي باتباع إجراء الكيمياء النسيجية المناعية الموضح في البروتوكول المكتوب المرفق لتثبيت الحبل الشوكي في وضع مفتوح. جهز العينة للتصوير.

قم بتوزيع الشحم أو السيليكون على شكل مستطيل على شريحة زجاجية، ثم ضع قطرات من PBS داخل المستطيل. استخدم ملقطاً لوضع الحبل الشوكي بحيث يكون ممدداً في منتصف المستطيل، ثم اسحب السائل المحيط به. وباستخدام ماصة، ضع قطرة إلى قطرتين من وسط التثبيت فوق الحبل الشوكي وقم بتغطيته بغطاء الشريحة.

اضغط على غطاء الشريحة لتجنب تكون فقاعات هوائية. واحفظ الشرائح في الظلام عند درجة حرارة 4 °C.

افحص النخاع الشوكي باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). تظهر هنا بعض النتائج التمثيلية لمسارات المحاور العصبية للعصبونات البينية في النخاع الشوكي للدجاج في تجارب الضبط، حيث يتم التعبير عن RFP في جميع العصبونات باستخدام عنصر مُعزز واسع الانتشار من CMV، مما يؤدي إلى وسم معظم العصبونات ومحاورها. ومن المستحيل في هذه الحالة فك تشفير مسار المحاور العصبية لمجموعات فرعية من العصبونات.

ومع ذلك، عند تطبيق عناصر تعزيز محددة، يظهر مسار محوري محدد لمجموعة فرعية من عصبونات DI two في هذا المثال. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء عملية كهربائية لأنبوب عصبي دجاجة باستخدام معزز عصبي محدد عند المرحلة E3، وكيفية تحضير نخاع شوكي مفتوح (open book) عند المرحلة E6. عند القيام بهذا الإجراء، يجب أن تتذكر أن تكون حذراً وصبوراً.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم. مع تمنياتنا لكم بالنجاح.