على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المعلمات المشبكية بشكل موضوعي ، بما في ذلك حجم المشبك والتجزئة والكثافة النسبية للبروتينات في الغشاء التالي للتشابك. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح العضلات ذات الأهمية من التجارب أولا. بعد ذلك ، يتم تقسيم العضلات المقطعة بالتبريد ، والأقسام عبارة عن صبغة مناعية للفحص المجهري الفلوري.

ثم في phos ، يتم أخذ عينات موضوعية من صور الوصلات العصبية العضلية من مجموعات العلاج المختلفة ، ويتم تحديد الكثافة النسبية للتلوين للتخصصات المتشابكة. في النهاية ، يتم الحصول على مقاييس كمية قابلة للتكرار لتأثيرات العلاج أو التعديل الجيني على التنظيم الهيكلي للوصلة العصبية العضلية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. حسنا ، توفر هذه الطريقة بروتوكولات موضوعية موحدة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم التغيرات في بنية الوصلة العصبية العضلية في نماذج الفئران لاضطرابات مثل الوهن العضلي الوبيل ومرض الخلايا العصبية الحركية.

بشكل عام ، قد يجد الأشخاص الذين يحاولون هذه الطريقة صعوبة لأن أخذ عينات من NPLS على المجهر متحد البؤر بطريقة غير متحيزة وموضوعية يتطلب التخطيط بعد أخذ العينات من NPLS يجب إجراء تحليل بطريقة متسقة وقابلة للتكرار حيث يمكن أن يؤدي التباين من إلى بين معلمات nplate هذا الأمر صعبا. بعد عزل التشريح بالتبريد والتلوين المناعي الفلوري ، فإن الوصلات العصبية العضلية للفأر أو njs ، وفقا لبروتوكول النص ، تعمي الشرائح عن طريق تسمية كل واحدة برقم عشوائي يظل معروفا فقط للباحث الثاني حتى بعد اكتمال القياس الكمي لمعلمات NMJ. ضع شريحة على مرحلة المجهر واستخدم مجموعة مرشح C مبتذلة لعرضها تحت إضاءة المجال الواسع.

تحرك تدريجيا عبر الحقول من اليسار إلى اليمين والخلف حتى تظهر صفيحة طرفية في الحقل مع ضبط الثقب متحد البؤر على وحدة جيدة التهوية 1.0 ، وباستخدام طاقة ليزر منخفضة ، قم بتحسين مستويات الكسب والإزاحة ل BGT الأحمر المبتذل C في اللوحة النهائية المراد تصويرها. بعد ذلك ، باستخدام ليزر 488 نانومتر ، قم بتحسين مضان C المناسب ، والذي يمثل synaptophysin ، ثم اجمع كومة Z من اللوحة النهائية بفاصل زمني 0.7 ميكرون بين كل شريحة بصرية. احفظ الصور باسم ملف يتضمن تاريخ جلسة التصوير واسم رمز الشريحة ورقم لوحة النهاية.

كرر إجراء أخذ العينات والتصوير الموضح للتو حتى يتم جمع 20 لوحة طرفية من الشريحة أو العينة. ثم كرر العملية للشرائح المشفرة المتبقية تحت نفس الإعدادات متحد البؤر. التقط بعض الصور من شريحة التحكم.

استخدم البرنامج المجاني للصورة J لفتح Zack وفي قناة فلورسنت واحدة ، قم بإعداد صورة عرض قصوى. احفظ الإسقاطات كملفات TIF باسم الملف، بما في ذلك تاريخ جلسة جلسة الصورة ونموذج التعليمات البرمجية ورقم اللوحة النهائية وقناة الفلورسنت. الآن استخدم الصورة J لفتح الإسقاط Z.

حدد مستقبلات الأسيتيل كولين أو قناة صورة CHR وحدد نوع الصورة ثمانية بت لتحويل الصورة الملونة 24 بت RGB إلى صورة واحدة بمقياس رمادي ثمانية بت على الشاشة باستخدام أداة المضلع. في قناة صبغة BGT الحمراء ، ارسم مخططا تقريبيا حول الصفيحة النهائية محل الاهتمام ، باستثناء أي تلطيخ لا ينشأ من الصفيحة النهائية ذات الاهتمام. حدد عتبة ضبط الصورة لتطبيق حد أدنى للشدة على الصورة.

اضبط مستوى العتبة لعزل الأجزاء الملطخة ب A CHR مع استبعاد إشارة الخلفية المحيطة كعتبة فرعية. ثم افتح نافذة ثانية بالصورة الأصلية ذات اللون الكامل للمقارنة. لتأكيد إعدادات العتبة مع استمرار وجود مخطط المضلع، حدد تحليل الجسيمات وتحليلها في القائمة المنبثقة.

حدد نطاق الأحجام في عدد وحدات البكسل من 50 إلى ما لا نهاية ، مما يلغي اختيار القطع الأثرية الصغيرة الناشئة عن الضوضاء الكهربائية. في مضاعف الصورة ، انقر فوق تحليل الجسيمات لإنشاء نافذة بها قائمة بمناطق العتبة فوق السرية وقيم شدة التألق المرقمة كما تظهر في الصورة الثنائية. انسخ هذه البيانات إلى جدول بيانات مصنف لقياس إجمالي مساحة لوحة النهاية.

داخل المضلع، حدد تحليل وقياس ونسخ ولصق البيانات الخاصة بمناطق وكثافة CHR في جدول بيانات بأعمدة مصنفة. قم بالتبديل إلى قناة synaptophysin. قم بإعداد صورة عرض قصوى.

حدد منطقة اهتمام، وقم بتعيين الحد الأدنى للكثافة كما هو موضح للتو. لقياس منطقة التداخل، قم بتطبيق الخطوات التالية. افتح الملف الأصلي الذي يحتوي على صورتي القناة وحدد مكدسات الصور.

قم بتكديسها إلى الصور لتقسيمها إلى صورتين منفصلتين. باستخدام المكون الإضافي للصورة J colocalization ، حدد المكون الإضافي colocalization وأدخل قيم العتبة المسجلة مسبقا ل A CHR والقنوات العصبية في مربع استعلام القناة المعني. والنتيجة هي صورة متداخلة بوحدات البكسل البيضاء.

قم بتحويل صورة التداخل التي تم إنشاؤها حديثا إلى تنسيق مقياس رمادي وقم بتطبيق عتبة على القيمة القصوى ، والتي ستحدد فقط وحدات البكسل البيضاء المقابلة لمنطقة التداخل للقناتين السابقتين. سجل في جدول البيانات قيمة المنطقة الناتجة للتحديد المشترك، والتي تمثل منطقة التداخل بالبكسل، وقم بإعداد جدول بيانات للبيانات. العينة تعني حساب ورسم الانحرافات المعيارية والأخطاء المعيارية كرسوم بيانية أو مخططات مبعثرة.

رسم ولوحة مناطق CHR على شكل مخططات مبعثرة أو رسوم بيانية للتردد لتحديد ما إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي قبل الاختبار الإحصائي. بعد إعداد تلطيخ الفلورسنت المناعي وتصوير أقسام ألياف العضلات المستعرضة كما هو موضح في بروتوكول النص ، افتح ملف صورة أصلي وأثناء عرض قناة A CHR ، حدد مكدسات الصور المكدسة إلى الصور لتقسيم القنوات حدد نوع الصورة ثمانية بت لتحويل تنسيق مقياس رمادي ثمانية بت إلى الشاشة. افعل ذلك لكلتا القناتين المضتان.

حدد الصور المكدسة لتكديس وفتح مكدس جديد من صورتين مفصولتين مسبقا بثمانية بت، مما يتيح التبديل بين قناتي التألق داخل النافذة الفردية باستخدام أداة المضلع. ارسم خطا بإحكام حول حدود تلطيخ A CHR ، وحدد تحليل القياس لقياس متوسط كثافة A CHR داخل المنطقة المغلقة. انسخ هذه القيمة إلى جدول بيانات مصنف مع الاحتفاظ بمخطط المضلع.

قم بالتبديل إلى قناة التألق الثانية وحدد تحليل القياس. سيؤدي ذلك إلى متوسط تلطيخ البروتين محل الاهتمام داخل المنطقة المشبكية المحددة بواسطة تلطيخ CHR. اختر منطقة بعيدة عن تلطيخ الصفيحة الطرفية المرئية.

ثم حدد تحليل القياس لقياس متوسط شدة مضان الخلفية. كرر القياس لقنوات التألق الأخرى وانسخ قيم الخلفية في جدول بيانات قيم التألق. اطرح متوسط قيم الخلفية من قيم الصفيحة النهائية للحصول على الشدة المصححة ل A CHR والبروتين محل الاهتمام في كل صفيحة طرفية.

أخيرا ، اقسم قيم شدة nplate المصححة للبروتين محل الاهتمام على شدة مضان BGT المصححة لإنتاج نسب شدة التألق كما هو موضح هنا. ترتفع شدة التألق لكل من CHR و synaptophysin بشكل حاد عند الحدود بين الجزء المشبكي والمشبكي PERS من لوحة نهاية المحرك. بالنسبة لمثل هذه الصور ، فإن الحد الأدنى من العتبة سيعزل بسهولة المنطقة الغنية ب A CHR أو النسيج المشابك في الصفيحة النهائية.

كما هو موضح في هذا الشكل في الفئران المسنة وفي بعض الحالات المرضية ، قد يكون تلطيخ الصفيحة النهائية للفيزياء المشبكية أقل كثافة. قد تظهر حواف مجموعة CHR غير واضحة ، وقد تكون هناك مستويات أعلى من مخططات التشتت الذاتي المضاقة الإضافية المشبكية تكشف عن نطاق كبير في المنطقة الغنية ب A CHR بين الصفائح الطرفية للعضلة الأمامية للظنوب لأي فأر فردي. ومع ذلك ، فإن متوسط مساحة CHR على أساس 15 إلى 20 على صور الصفيحة النهائية للوجه كان متشابها بين سبعة عينة من الفئران في المقاطع المستعرضة ، تظهر صفيحة النهاية عادة على شكل هلال ، ولكن هذا الشكل غالبا ما يكون غير منتظم كما هو موضح هنا.

يكشف تألق الخلفية منخفض الكثافة كما هو موضح هنا على قناة Synaptophysin عما إذا كانت رقعة تلطيخ CHR تمثل صفيحة نهاية واحدة أو صفيحتين طرفيتين منفصلتين تقعان على ألياف عضلية مجاورة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توطين العديد من البروتينات المشبكية مثل رابسون والمسك وبيتا ديسترو جليكان مع CHR في nplate. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يظل المجربون أعمى عن مجموعات العلاج والنمط الجيني أثناء أخذ العينات وتحليل صور nplate.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع وأخذ عينات وتحليل الصور الفلورية متحدة البؤر للوصلات العصبية العضلية. في النهاية ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على مقارنة المعلمات الهيكلية المختلفة للصفيحة بين مجموعات المعالجة والأنماط الجينية المختلفة بشكل متسق وموضوعي.