ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي KCNJ10 (Kir4.1)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم حالة مثيلة الحمض النووي ل KCNJ 10 في مجموعة غنية من الخلايا النجمية وربط تغيرات مثيلة الحمض النووي للمحفز بنشاط اختياري للنسخ. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل مجموعة غنية من الخلايا النجمية القشرية أولا من دماغ القوارض بأكملها عن طريق فرز الحقائق التالية يتم عزل الحمض النووي من السكان المخصبين للخلايا النجمية. ثم يتم تقييم حالة مثيلة الحمض النووي ل KC J 10 باستخدام تحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة أو MS. HRMA.

أخيرا ، يتم فرط ميثيل KC J 10 ويتم استخدام مقايسة اللوسيفر لربط التغيرات في مثيلة الحمض النووي للمحفز بنشاط النسخ. في النهاية ، MS. يتم استخدام HRMA ومقايسة لوسيفيراز لقياس حالة مثيلة الحمض النووي ل KCNJ 10 وربط التغييرات في مثيلة المحفز ونشاط النسخ للجين الذي سينظر إلى الإجراء. زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري ، تم التعامل مع جميع وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة ، ووافقت لجنة رعاية واستخدامه في جامعة ألاباما في برمنغهام على استخدام.

تم إعداد جميع المخازن المؤقتة والكواشف وفقا لبروتوكول النص. بعد تشريح القشرة من رأس قتل رحيم ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع أو إحداث ثقب في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للسماح بإدخال الأنابيب في الأنبوب. ثم أضف محلول البابين إلى الأنبوب.

ضع القشرة المقطعة في طبق استزراع 10 ملم يحتوي على وسط تفكك متوازن إلى 95٪ O2 إلى 5٪ CO2 ، واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لفرم الأنسجة إلى قطع واحدة في مليمتر مربع. باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ، ينقل الرجال الأنسجة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول البيبان. اترك الأنسجة تستقر في قاع ماصة النقل قبل تفريغها.

لتقليل كمية وسط التفكك المنقولة دون فقاعات محلول البيبان ، قم بتطبيق تدفق ثابت من 95٪ O2 إلى 5٪ CO2 عبر تبادل الغازات السطحية أثناء الحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم ماصة نقل 10 مل لتنظيف الأنسجة ببطء 10 مرات بالطرد المركزي لتعليق الخلية الغائمة عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بموازنة محلول مثبط الألبومين في الحمض النووي عن طريق تبادل الغازات السطحية وإعادة تعليق الخلايا المحببة في ثلاثة ملليلتر من المحلول.

ثم قم بإعداد تدرج كثافة متقطع تجاري باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتدوير تدرج الكثافة المتقطع عند 70 جم لمدة ست دقائق. ثم اعزل الخلايا المنفصلة عن قاع الأنبوب باستخدام ماصة لشفط الوسائط.

استخدم ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من DPBS مع 0.02٪ ألبومين مصل بقري ومليغرام واحد لكل مليلتر من الحمض النووي أو الوسائط المفضلة. لإعادة ، قم بتعليق الخلايا المنفصلة. قم بتمرير الخلايا عبر مرشح 40 ميكروغرام قبل إجراء فرز الحقائق واستخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول النص.

بعد تصميم بادئات مقابل تسلسل الحمض النووي المحول ثنائي الكبريتيت وتضخيم الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص بواسطة الكبريتيت ، قم بتحويل 500 إلى 1000 نانوجرام من الحمض النووي لكل عينة ومعايير الحمض النووي الميثيلية التي تتراوح من صفر إلى 100٪ من نفس الأنواع الحيوانية باستخدام بوليميراز الحمض النووي المفضل وخمسة بادئات ميكرومولار. قم بإعداد تفاعلات 20 ميكرولتر لتضخيم MS HRM. وفقا لهذا الجدول ، قم بتشغيل جميع العينات بما في ذلك الفاكس والحمض النووي ومعايير الميثيل في ثلاث نسخ اعتمادا على مجموعة برامج التحليل ، ومعلمات البدء والإيقاف قبل وبعد حول انتقالات منحنى الذوبان.

اضبط معلمات توقف الذوبان والبدء والذوبان المبكر. إذن، الفرق بين الاثنين يساوي 0.2 إلى 0.5 درجة سلزية. قم بتعيين ما بعد الذوبان والبدء والتوقف بالمثل واستخرج بيانات فرق درجة حرارة الذروة لكل عينة باستخدام معايير الميثيل المئوية والاختلافات في درجات حرارة الذروة المقابلة لها.

إنشاء معادلة انحدار خطي. استخدم معادلة الانحدار الخطي هذه لتقدير حالة مثيلة العينات غير المعروفة بعد تحديد جزر CPG ذات الأهمية وتضخيم واستنساخ جزيرة CPG Luke two البلازميد وفقا لبروتوكول النص. استخدم برنامج القطع المفضل للتحقق من مواقع ملخص التقييد لتجنب التخفيضات المزدوجة وخطية 30 ميكروغراما من البلازميد بمجرد هضم العينة بالإنزيمات المناسبة.

الإنزيمات الحرارة عند درجة الحرارة والمدة المناسبة في تفاعلات 50 ميكرولتر. استخدم خمس وحدات من ميثيلات CPG للميثيليات. 700 ميكروغرام من البلازميدات الخطية عند 30 درجة مئوية لمدة 13 إلى 19 ساعة.

بعد تنظيف الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء ملخص تقييد HPA على عينة ميكروغرام واحدة من الحمض النووي الميثيلي عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد تنظيف الحمض النووي ، قم بتشغيل العينات على 1٪ agros ، هلام الحمض النووي عند 100 فولت لمدة 45 دقيقة للتصور. الموضوع التالي ، البلازميدات الميثيلية وغير الميثيلة لمضاعفة الهضم مع إنزيمات التقييد المناسبة بين عشية وضحاها لإطلاق شظايا لوقا اثنين من المتجهات وجزيرة CPG بطول كامل.

الحرارة تعطيل الإنزيمات بعد الهضم. قم بتشغيل العينات المهضومة المزدوجة على هلام 1٪ DNA agros عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة لفصل المتجه وإدخاله ، ثم أثناء ارتداء الحماية من الأشعة فوق البنفسجية ، ضع الجل على ضوء أسود وبشفرات جراحية نظيفة ، قم باستئصال الإدخالات الميثيلية وغير الميثيلية بعد استخراج الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص ، استخدم T أربعة DNA Ligase ونسبة واحد إلى أربعة من المتجه لإدخاله لإدراج الإدخالات الميثيلية وغير الميثيلية إلى ناقل غير ميثيلي. احتضن عند سالب 20 درجة مئوية أو على الجليد طوال الليل بعد الربط.

قم بتنظيف الحمض النووي والتحقق من إعادة الربط عن طريق تشغيل عينات على هلام DNA aros بنسبة 1٪ وتقييم تركيز خلايا البلازميد المعاد ربطها CD 54 على صفيحة 12 بئرا عند 140،000 خلية لكل بئر. بعد 24 ساعة. استخدم كاشف تعداء تجاري لنقل الخلايا بتركيزات متساوية إما من حلقة CPG غير الميثيلية ، أو اثنين من البلازميد بالإضافة إلى RAN أو الفانيليا أو ناقل حديد آخر أو ميثليته c pg Luke اثنين من البلازميد بالإضافة إلى ELLA أو ناقل لوسيفر التحكم الآخر اسمح للخلايا بالتعدين لمدة 24 ساعة قبل إجراء فحص اللوسيفر.

وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، استخدم مقياس الإضاءة لقراءة كل بئر في ثلاث نسخ. احسب نسبة نشاط اليراع لوسيفر إلى تشغيل الفانيليا أو أي عنصر تحكم آخر. نشاط لوسيفر.

تطبيع نشاط لوسيفيراز التحكم في اليراع الميثيلي إلى نشاط لوسيفيراز التحكم في اليراع غير الميثيلي عن طريق قسمة النشاط الميثيلي على نشاط لوك الميثيلي. كما هو موضح هنا ، تم الحصول على مجموعة غنية من الخلايا النجمية عن طريق الفرز بالفاكس للحيوانات المعدلة وراثيا بيتا 100. تم استهداف مجموعة مسورة بناء على التشتت الأمامي والجانبي ، وتم تحديد مجموعة الخلايا الحية باستخدام مؤشر الخلايا الميتة البروميد والبوابة الموضحة هنا هي صور تمثيلية للخلايا النجمية الإيجابية EGFP بعد التفكك ، ولكن قبل الفرز وكذلك بعد الفرز ، يظهر هذا الشكل مجموعة خلايا إيجابية معزولة ل EGFP أظهرت زيادة بمقدار 40 ضعفا في mRNA لعلامة الخلايا النجمية المحددة.

أ LDH واحد L واحد. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من التعبير المشترك عن S 100 beta و NG اثنين من OPCs الإيجابية والخلايا النجمية ، فقد لوحظ انخفاض أربعة أضعاف في NG اثنين من mRNA ، وقد لوحظ علامة لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن تشير إلى عزل مجموعة الخلايا النجمية المخصبة. يسرد هذا الجدول إجمالي الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، المعزول عن أعمار وعدد مختلف من ، ويتم إدراجه كمرجع للعائد المتوقع للجزيئات الجزيئية بعد الحقائق.

أخيرا ، تم استخدام مقايسة اللوسيفر المزدوجة لتقييم نشاط النسخ للمناطق المفرطة الميثيل للجين محل الاهتمام بعد نقل الإدخال الميثيلي إلى ناقل غير ميثيلي. تم استخدام HPA two ، الذي يهضم فقط الحمض النووي غير الميثيلي للتحقق من حالة مثيلة البلازميد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجموعة من الخلايا النجمية المثرية باستخدام الحقائق بالإضافة إلى كيفية قياس مثيلة الحمض النووي للجين وربط التغييرات في مثيلة الحمض النووي للمحفز بنشاط النسخ باستخدام تحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة ومقايسة لوسيفيراز على التوالي.