الكشف عن Exosomal العلامات البيولوجية التي يسببها الميدانية الكهربائية الإصدار والقياس (EFIRM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج الإكسوسومات بكفاءة من السوائل الحيوية ، وطرد البضائع الخارجية ، وتحليل البضائع بسرعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج الإكسوسومات أولا من السوائل الحيوية باستخدام الجسيمات الدقيقة المغناطيسية مع علامة الإكسوسوم التي تستهدف الأجسام المضادة ، ثم تحميل الإكسوسومات المستخرجة على سطح القطب. بعد ذلك ، يتم وضع الإكسوسوم باستخدام مجال كهربائي ويتم تهجين شحنة الإكسوسوم إلى مجسات على سطح القطب.

يتم تهجين جزيء المراسل أيضا إلى النظام. الخطوة الأخيرة هي إضافة محلول ركيزة إلى سطح القطب الكهربائي ثم الحصول على القراءة عن طريق قياس التيار الكهربائي. في النهاية ، يتم استخدام القياس الكهروكيميائي للتيار لإظهار كمية الحمض النووي أو محتوى البروتين في عينة الإكسوسوم.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية ، مثل التركيز الفائق والمخزن المؤقت لليسين ، هي أنها طريقة سريعة بسيطة لاستخراج واختبار محتوى الإكسوسوم. نحن متحمسون جدا لهذه التكنولوجيا لأنه لأول مرة ، تسمح لنا تقنية efim هذه باستخدام المعلومات التي يتم إلقاؤها بواسطة الأعضاء في حالة المرض أو في الحياة الطبيعية التي يتم التخلص منها بواسطة العضو الأصلي من خلال الأوعية الدموية وعند دخولها إلى تجويف الفم. تسمح لنا هذه التقنية بالتقاط هذه المعلومات وإطلاق المحتوى الجزيئي الذي يمكننا اكتشافه بشكل متزامن بطريقة مرنة.

هذه المعلومات التمييزية للمرض ، بشكل عام ، قد يكافح المستخدمون الجدد في هذه الطريقة لأن استخدام الجسيمات الدقيقة المغناطيسية قد يكون صعبا إذا لم يكن المرء حريصا. علاوة على ذلك ، قد يكون استخدام الطرق الكهروكيميائية في تحليل العينات البيولوجية نموذجا جديدا لبعض العروض المرئية لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الجسيمات الدقيقة المغناطيسية والتحميل الكهربائي. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند التعامل مع الجسيمات الدقيقة المغناطيسية وتحميلها على الإلكترولود.

لبدء التعليق ، محلول مخزون يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية المطلية ب Strept Adin وإضافة خمسة ميكرولترات. محلول لأنبوب الطرد المركزي الصغير الذي يحتوي على 495 ميكرولتر من PBS لغسل الخرز. أولا ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة المخزن المؤقت بعناية دون إزعاج الخرز.

ثم انقل الأنبوب إلى رف غير مغناطيسي. أضف 500 ميكرولتر من PBS و PET لغسل الخرز. افعل ذلك ما مجموعه ثلاث مرات بعد إعادة الغسيل النهائي.

الخرزات في 490 ميكرولتر من PBS ثم أضف خمسة ميكرولترات من الجسم المضاد للفأر المضاد للإنسان CD 63 من محلول مخزون واحد ملليغرام لكل مليلتر. امزج المحلول عن طريق ماصة برنامج دوار عينة للدوران المتبادل عند 90 درجة لمدة خمس ثوان والاهتزاز عند خمس درجات لمدة ثانية واحدة. ضع الأنابيب في الدوار وقم بتشغيل البرنامج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، انقل الأنابيب إلى الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS ثم أعد تعليقها في 490 ميكرولتر من PBS المحتوي على Caine. قم بتسمية أنبوب بتحديد العينة ثم أضف 10 ميكرولترات من ماصة العينة عدة مرات لخلط العينة مع الخرز المترافق بالجسم المضاد.

بعد ذلك ، انقل الأنابيب إلى محور دوار العينة وقم بتشغيل نفس البرنامج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخرزة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول هيدروكلوريد ثلاثي مولي واحد. باستخدام الرف الممغنط ، يتم الآن ربط الإكسوسومات بالخرز الممغنط لتجهيز القطب الكهربائي.

أول كواشف مخزون مخففة للمسبار ، كلوريد البوتاسيوم ، ومونومر أولي في الماء المقطر. مسبار الحمض النووي الحيوي الخمسة الرئيسي خاص ب GA DH mRNA. امزج محلول مسبار المونومر عن طريق الدوامة.

استخدم مصفوفة أقطاب كهربائية مكونة من 16 مستشعرا يتكون فيها كل قطب كهربائي من عداد عمل وأقطاب كهربائية مرجعية مكونة من الذهب العاري. ضع بئر بلاستيكي على مصفوفة الأقطاب الكهربائية لمنع التلوث المتبادل للأقطاب الكهربائية. انقل 60 ميكرولترا من محلول مسبار المونومر إلى سطح قطب ذهبي بحيث يتم تغطية عداد العمل والأقطاب الكهربائية المرجعية بالسائل.

قم بتطبيق ملف تعريف مجال كهربائي دائري للموجة المربعة يعرف باسم مجال A-C-S-W-E على مسبار مونومر مبلمر كهربائيا. هذا يخلق طبقة بوليمر موصلة على سطح القطب. اشطف المستشعر ثلاث مرات بالماء المقطر ثم جففه بغاز النيتروجين لإزالة السائل من سطح القطب.

بعد تجهيز القطب الكهربائي باستخدام مسبار الالتقاط ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول ميكرومولار واحد لمسبار الكاشف إلى 495 ميكرولتر من محلول مركب الإكسوسوم المصنوع من الخرزة ، ثم اخلطه عن طريق سحب العينات. هنا. المسبار عبارة عن برايمر DNA مترافق بثلاثة فلورسينات رئيسي خاص ب GA dh. تم وضع مصفوفة أقطاب كهربائية مشفرة مسبقا فوق مصفوفة مغناطيسية تتكون من 16 مغناطيسا محاذاة للأقطاب الكهربائية العاملة للمستشعر.

ثم انقل 60 ميكرولترا من محلول الإكسوسوم المصنوع من الخرزة إلى سطح القطب. قم بتطبيق حقل A-C-S-W-E لمدة 20 دورة. سوف تهجين الشحنة الخارجية التي تم إطلاقها إلى المسبار الموجود على سطح القطب.

اشطف سطح القطب ثلاث مرات بالماء المقطر لإزالة أي تحليلات غير مرتبطة ، ثم ارسم القطب بغاز النيتروجين. بعد ذلك ، قم بعمل تخفيف واحد إلى 1000 من الجسم المضاد المترافق المضاد للفلورسين HRP في PBS الذي يحتوي على Caine. ثم أضف 60 ميكرولترا من تخفيف الجسم المضاد إلى سطح القطب.

قم بتطبيق مجال A-C-S-W-E على سطح القطب الكهربائي لتقران الجسم المضاد HRP المضاد للفلورسين بمسبار الكاشف. اشطف سطح المستشعر ثلاث مرات بالماء المقطر لإزالة الجسم المضاد الزائد ، ثم اسحب القطب بغاز النيتروجين. بعد ذلك ، قم بتحميل 60 ميكرولترا من ركيزة TMB على كل سطح مستشعر باستخدام ماصة متعددة القنوات باستخدام إحصائيات الإمكانات الكهروكيميائية لقياس تيار القطب عند سالب 200 مللي فولت لمدة 60 ثانية.

للحصول على قراءة التريكية ، تم استخدام المجهر الإلكتروني لتحديد ما إذا كانت الإكسوسومات مرتبطة بالخرز المغناطيسي. تتوافق الحبيبات التي يتراوح حجمها بين 70 و 100 نانومتر والمرفقة بالخرز مع الحجم المعروف للإكسوسومات عند التحلل بواسطة المجال الكهربائي أو المنظف. لا توجد أجومات خارجية واضحة بالقرب من الخرز.

تم الكشف عن GA DH mRNA في الإكسوسومات عن طريق القراءة السريعة. تنخفض كمية GA DH الموجودة بمرور الوقت كما هو متوقع عند تحلل الإكسوسوم إما بواسطة المجال الكهربائي أو المنظف ، مما يشير إلى التعرض للبيئة الحويصلية الإضافية للعاب. تم استخدام Efim لقياس المحتوى الخارجي للجسم في المصل ولعاب الفئران التي تم حقنها بخلايا سرطان الرئة البشرية التي تنتج علامة CD 63 GFP Exo Somal البشرية.

بعد 20 يوما ، تم العثور على مستويات أعلى من CD 63 GFP في كل من المصل والسالي للفئران المحقونة بالخلايا السرطانية ، ولكن ليس في الفئران المحقونة المالحة. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب لمس الخرزات لاستخراج كمية كافية من السائل عند غسل الخرز لغسل سطح القطب بشكل موحد ، وتحميل المناطق الموجودة على القطب بشكل صحيح. هذه التكنولوجيا ، هذه التكنولوجيا efim ، وفرت تلك القدرة الحرجة غير الملباة لكيفية قيام مرض جهازي ، عضو بعيد ، بإلقاء معلوماته وحسابها في هذا الكيان المسمى exosomes.

كيف يدخلون إلى اللعاب ، في تجويف الفم لدينا ويكونوا قادرين على التقاط الإكسوسومات ، وإطلاق هذه الأهداف الجزيئية ، والسماح باكتشافها بشكل متزامن مثل الأمراض المهددة أو السكري أو سرطان البنكرياس أو غيرها من الاضطرابات التي تهدد الحياة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج الإكسوسومات بسرعة من السائل الحيوي ، وكيفية تفريغ حمولة الإكسوسومات ، وكيفية تحليل محتوى الإكسوسومات بسرعة باستخدام نظام قطب كهربائي متكامل.