العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على جزء غير نووي مخصب بمقصورات النسخ المتماثل التي تشكلت في الخلايا المصابة بالفيروس الغدي لإجراء دراسة مفصلة لتكوينها وهيكلها الفائق والأنشطة المرتبطة بها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال فيروسات الحمض النووي ، مثل دراسة الآليات الجزيئية التي تتحكم في تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عنه والتي تعتمد بدورها على مقصورات النسخ المتماثل لتنظيم تفاعلات الخلايا المضيفة للفيروس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها إجراء بسيط يعتمد على تدرج السرعة لإنشاء نظام خال من الخلايا قابل لدراسة الآليات التي تسمح لفيروسات الحمض النووي المتكاثرة النووية بالسيطرة على الخلية المصابة.

من أجل إجراء هذا الفحص ، أولا ، قم بإعداد الفيروس الغدي من النوع الخامس أو D خمسة والخلايا الليفية للقلفة البشرية أو HFF كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب لبدء إصابة 10 إلى HFF السابع في أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم باستخدام مليلتر واحد من 85 و DMM لكل طبق في وزارة الداخلية من 30 وحدة تشكيل التركيز أو FFU لكل خلية تحتضن الخلايا لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. هز الأطباق بعناية كل 15 دقيقة لضمان التوزيع المتجانس للقاح الفيروس على الخلايا. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط وإضافة dmem الطازج.

تستكمل ب 10٪ FBS ثم تحتضن الخلايا لمدة 16 أو 24 أو 36 ساعة باستخدام مكشطة الخلية. حصاد الخلايا المصابة برفق والتحكم فيها بعد الإصابة وجمع معلق الخلية في أنابيب طرد مركزي معقمة على الجليد. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 220 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من جهاز الطرد المركزي PBS المثلج وغسل الخلايا ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من PBS المثلج البارد للتخلص من المواد الطافية للغسيل من أجل قمل الخلايا. Resus ، قم بتعليق حبيبات الخلية في 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت المنخفض التوتر المثلج البارد مع مثبطات البروتياز والسماح للخلايا بالانتفاخ على الجليد لمدة ثلاث ساعات. باستخدام مدقة تفلون من النوع A ، قم بتجانس الخلايا ب 10 إلى 20 ضربة لأسفل.

افحص المحللة تحت المجهر بشكل دوري كل 20 ضربة لمراقبة تحلل الخلايا. كرر العملية لحوالي 80 ضربة حتى تتمزق جميع الخلايا بنجاح. بعد ذلك ، قم بعمل الطرد المركزي المتجانس عند 300 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بتخزين المادة الطافية عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر في أنبوب كجزء سيتوبلازمي لإزالة الحطام الخلوي من النوى الرئيسية. قم بتعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من محلول السكروز المولي 0.25 ماصة واحدة 750 ميكرولتر من محلول السكروز المولي 0.35 اثنان في أنبوب طرد مركزي وطبقة من التجانس المعلق بعناية فوق المحلول الثاني. قم بتدوير وسادة السكروز عند 1400 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من المحلول الثاني للقمل. النوى صوتنة التعليق النووي في حمام بالموجات فوق الصوتية ، يتم الحفاظ عليها عند أو أقل من أربع درجات مئوية في نبضتين لمدة خمس دقائق. تحقق من التحلل النووي تحت مجهر المجال الساطع بين النبضات والصوتنة بشكل أكبر حتى تكذب النوى تماما.

الماصة التالية 750 ميكرولتر من 0.88 مولي سكروز محلول ثلاثة في طبقة أنبوب الطرد المركزي محلول المحللة النووية على الحل ثلاثة. جهاز الطرد المركزي المحلل عند 3000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. 1.5 ملليلتر S المسمى هو جزء النواة البلازمي ، والذي يتم تخزينه عند 70 درجة مئوية تحت الصفر.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 700 ميكرولتر من المحلول الثاني. هذا هو جزء حجرة النسخ المتماثل 85 أو RCF للنواة المضيفة ، والذي يتم تخزينه أيضا عند 70 درجة مئوية تحت الصفر. لبدء تحليل التألق المناعي ، أضف قطرة خمسة ميكرولتر من RCF إلى شريحة زجاجية مطلية بالمحلول الملحي.

دع القطرة تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 500 ميكرولتر من PBS في قطرة بجانب البقعة وقم بإمالة الشريحة لتدفق PBS فوق البقعة. استنزاف PBS من الشريحة.

بعد ذلك ، قم بحظر بقعة العينة ب 500 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 5٪ من ألبومين مصل الأبقار لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. لإزالة محلول الحجب الزائد ، أضف 500 ميكرولتر من PBS برفق إلى العينة المرقطة على الشريحة دون سحب العينة مباشرة على العينة. قم بالغسيل ثلاث مرات.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من الجسم المضاد الأولي المخفف ضد البروتين الفيروسي E two A المرتبط بالحمض النووي في بقعة العينة. قم بتغطية الشريحة لتجنب التبخر واحتضانها في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. الآن ، اغسل العينة ثلاث مرات برفق باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.02٪ توين 20.

تجنب سحب العينة مباشرة على العينة بعد هذه الغسل. أضف 20 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي للفأر الفلورو أربعة مباشرة على العينة ، واحتضنه عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. في غرفة مرطبة ، أضف 500 ميكرولتر من PBS مع 0.02٪ Tween 20 إلى الشرائح ، مرة أخرى ، مع تجنب سحب العينة مباشرة على العينة.

ثم أضف ميكرولترين من محلول التركيب واقلب زلة الغطاء فوق العينة. أغلق جوانب زلات الغطاء بطلاء الأظافر. اعرض الشريحة تحت المجهر الفلوري بهدف 63 × عند الطول الموجي المطلوب المحدد للفلورو الأربعة المستخدم نتيجة من التألق المناعي للفيروسات الغدية E اثنين من بروتين ربط الحمض النووي أو DBP موضح هنا.

الهياكل المحتوية على DBP عبارة عن RC فيروسي نووي فرعي ، لاحظ أن E اثنين A DBP موضعية داخل RC وتظهر باللون الأخضر. بالإضافة إلى ذلك ، تم تأكيد تخصيب الحمض النووي الفيروسي في RCF عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يقارن RCF والجزء البلازمي النووي أو NPL في 24 و 36 ساعة بعد الإصابة. تم العثور على الوفاق الوطني الفيروسي بشكل انتقائي في إطار التعاون الإقليمي وليس في استشارة الاتفاق الوطني للخسارة.

النص المصاحب للحصول على دليل إضافي على الحمض النووي المتعدد للفيروسات الغدية في RCF بمجرد إتقان هذه التقنية يمكن إجراؤها في ستة من وقت حصاد الخلايا المصابة إلى عزل RCF إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما الاحتفاظ بالعينات على الجليد ومراقبة نواة التجانس والعزل والصوتنة وعزل الكسر النووي الفرعي عن طريق الفحص المجهري للمجال الساطع. باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل R-T-P-C-R والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال من أجل دراسة تنظيم التعبير الجيني الفيروسي المرتبط بمقصورات التكاثر الفيروسي والبنية الفائقة لهذه الجسيمات. هذه التقنية لديها القدرة على تمهيد الطريق للباحثين في مجال علم فيروسات ورم الحمض النووي لاستكشاف الآليات الجزيئية التي تغير تنظيم دورة الخلية وتعزز تكاثر الفيروس في الخلايا البشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مقصورات التكاثر الفيروسي من نوى الخلايا المصابة لإجراء دراسات مورفولوجية ووظيفية وتركيبية لهذه الهياكل التي يسببها الفيروس.

لا تنس أن العمل باستخدام مؤشر SAN يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما أخذ الإيقاع ، مثل ارتداء أفواه الأذن أثناء تنفيذ هذا الإجراء.