ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

الهدف العام لهذه التقنية هو التحقيق بشكل منهجي في مشهد مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم في مجموعات كبيرة من المرضى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال اللاجيني ، خاصة فيما يتعلق بالمناطق في مشهد مثيلة الحمض النووي التي يتم تحريرها في المرضى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن فحص عدد كبير من المرضى بطريقة فعالة من حيث التكلفة.

يمكن أن يكون لهذه التقنية آثار إيجابية في علاج وتشخيص المريض لأنه يمكننا التحقيق في المؤشرات الحيوية الموجودة وكذلك تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمجموعة المرضى ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل مثيلة الحمض النووي في الخلايا المشتقة من خطوط الخلايا المستزرعة من العينات المشتقة من الفئران. يوضح هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع الدكتور Ya-Ting Hsu السيد جوزيف ليو ، فني في مختبرنا.

سيتم عرض جزء التسلسل من قبل السيدة دون جارسيا وهي فنية في جوهر التسلسل لدينا. بعد عزل الحمض النووي الجيني عن الورم أو الأنسجة الطبيعية وفقا لبروتوكول النص ، أضف 1.2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الجيني إلى 96 ميكرولترا من المخزن المؤقت TE و 24 ميكرولترا من مخزن غسيل ربط 5X لعمل محلول 120 ميكرولتر. قم بتقطيع محلول الحمض النووي لمدة 30 ثانية ، ثم اتركه يرتاح لمدة 30 ثانية.

كرر الصوتنة ما مجموعه 20 إلى 25 مرة. استخدم نظام محلل حيوي مع مجموعة DNA تجارية عالية الحساسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتشغيل ميكرولتر واحد من محلول الحمض النووي الصوتي للتحقق من حجم الأجزاء. يجب أن تكون في حدود 150 إلى 350 زوجا أساسيا.

لإجراء شطف جزء واحد ، قم بإعداد مخزن مؤقت للشطف عن طريق عمل محلول واحد لواحد من المخزن المؤقت منخفض الملح والمخزن المؤقت عالي الملح. استخدم 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف لإعادة تعليق حبات الحمض النووي أو MBD المرتبطة بالميثيل واحتضان التعليق على خلاط دوار لمدة ثلاث دقائق. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بسحب السائل بعناية دون لمس طرف الماصة على الخرز ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من DNase سعة 1.5 مل.

قم بتخزين هذه العينة على الثلج. كرر الشطف للعينة الثانية واجمعها في نفس أنبوب العينة الأولى. إلى كل جزء غسيل وتخفيف غير ملتقط ، أضف ميكرولتر واحدا من الجليكوجين ، عشر حجم ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، ودرجة الحموضة 5.2 ، وحجمين من العينة 100٪ من الإيثانول.

بعد خلط المحلول جيدا ، احتضن عند سالب 80 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. ثم الطرد المركزي للتفاعل عند 11 ، 363 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأضف 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد 70٪.

قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى قبل تكرار غسل الإيثانول. جفف الحبيبات في الهواء لمدة خمس دقائق. ثم استخدم الماء الخالي من DNase أو المخزن المؤقت لإعادة تعليقه.

تأكد من أن الكمية الإجمالية للحمض النووي تزيد عن 20 نانوغراما وفقا لبروتوكول النص. ثم ضع الحمض النووي على الجليد أو قم بتخزينه على درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر. لإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي ، استخدم نظام إنشاء مكتبة مؤتمت بالكامل واتبع البروتوكول القياسي الذي توفره الشركة المصنعة.

حدد أجزاء الحمض النووي من 200 إلى 400 زوج أساسي في الطول لإعداد المكتبة. بعد إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي ، قم بإزالة التفاعل واستخدم نظام القياس الكمي الفلوري لتحديد مكتبة تسلسل الحمض النووي. لإعداد تفاعل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 15 ميكرولترا من مكتبة تسلسل الحمض النووي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 25 ميكرولترا من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الرئيسي ، وميكرولترين من مزيج التمهيدي PCR ، وثمانية ميكرولترات من الماء.

استخدم البرنامج الموضح في بروتوكول النص ، وقم بإجراء التعديلات حسب الضرورة بناء على توصيات الشركة المصنعة لمزيج PCR. قم بإجراء دورات كافية لإنتاج اثنين إلى 10 ملليمولار من الحمض النووي للمكتبة. بعد تنظيف تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بترميز كل عينة واسحب أربع عينات معا في حارة واحدة من خلية التدفق.

استخدم بروتوكول القراءة الفردية القياسي المكون من 50 زوجا أساسيا للتسلسل. إجراء المعلوماتية الحيوية وفقا لبروتوكول النص. باستخدام غطاء MBD يسعى إلى تحديد جزر CpG عبر مناطق جينومية مختلفة يتم ميثيليته تفاضليا في الورم فيما يتعلق بالأنسجة الطبيعية ، كشفت هذه الدراسة أنه من إجمالي جزر CpG الموجودة في محفزات الجينات ، أظهر 19.5٪ مثيلة تفاضلية في الأورام مقارنة بالوضع الطبيعي.

وبالمثل ، أظهرت 55.2٪ من جزر CpG داخل الجينات التي تم فحصها مثيلة تفاضلية. أظهر المروجون داخل الجينات 28.1٪ وبالنسبة لمروجي الجينات بدون جزر CpG ، أظهر 1.8٪ مثيلة تفاضلية. تصور هذه الخريطة الحرارية بوضوح مناطق ميثيلية تفاضلية عبر 77 ورما في الثدي ، و 10 أنسجة طبيعية للثدي ، و 38 خطا من خلايا سرطان الثدي.

في هذا الشكل ، يتم قياس المثيلة في مجموعتين فرعيتين لسرطان بطانة الرحم ، غير متكررة مقابل متكررة ، في مريضين في مواقع CpG مختلفة في جزيرة المحفز CpG للجين المستهدف المحدد SFRP1. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أولا اختبار جودة الحمض النووي الجيني الذي يتم اختباره. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق إضافية مثل pyrosequencing من أجل الإجابة على أسئلة مثل ، ما هي CpGs الدقيقة في المناطق المخصبة تفاضليا المحددة والتي تم تغييرها؟ بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق لاستكشاف مثيلة الحمض النووي في مجموعات كبيرة من المرضى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم في عينات المرضى باستخدام تقنية تسلسل غطاء MBD. ضع ذلك في الاعتبار ، في بعض الأحيان قد يكون من الصعب التقاط الجودة العالية للحمض النووي من عينات FFP و DNA ، لذلك يتم دائما إجراء التقييم المناسب للحمض النووي الجيني عند إجراء الإجراء.