ميثليته الحمض النووي مناعي

يوضح هذا الفيديو بروتوكولاً لعملية الترسيب المناعي للحمض النووي الميثيلي أو ما يعرف بـ MeDIP. وهي طريقة تُستخدم لعزل الحمض النووي الميثيلي بشكل محدد وبطريقة غير متحيزة. يتميز ميثيلة الحمض النووي في الثدييات بإضافة مجموعة ميثيل إلى الموضع C 5 من السيتوزين.

عندما يتواجد في ثنائي النوكليوتيد CPG، فإنه يمثل علامة فوق جينية عكوسة تلعب دوراً هاماً في التطور الطبيعي، بالإضافة إلى العديد من العمليات المرضية. وتشمل الوظائف الطبيعية لمثيلة الحمض النووي (DNA methylation) تعطيل الكروموسوم X لدى الإناث، وإسكات العناصر التكرارية، والبصمة الجينية، والحفاظ على الاستقرار الجينومي. كما ثبت أن مثيلة الحمض النووي تلعب دوراً في العديد من الأمراض مثل السرطان، ومتلازمة دي ويلي، ومتلازمة إنجلمان، ومتلازمة نقص المناعة وعدم استقرار السنترومير والتشوه الوجهي.

في حالات السرطان، على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي فرط الميثيل غير الطبيعي في المحفزات إلى إسكات جينات كابتة للأورام حيوية. بينما يؤدي نقص الميثيل غير السليم إلى عدم استقرار كروموسومي وتنشيط الجينات المسرطنة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تكسير الحمض النووي DNA باستخدام الموجات فوق الصوتية إلى قطع يتراوح حجمها من 300 إلى 1000 زوج قاعدي. ثم يتم مسخ الحمض النووي DNA الذي تعرض للموجات فوق الصوتية عند 95 درجة مئوية.

تُضاف الأجسام المضادة الأولية، التي تتعرف على 5-ميثيل سيتوزين، وتُترك لترتبط بقطع DNA الممثيلة. وتُستخدم الأجسام المضادة الثانوية، المقترنة بحبيبات dyna المغناطيسية، لعزل قطع DNA التي ارتبطت بالجسم المضاد الأولي. ثم تُزال القطع غير الممثيلة ويتم هضم الأجسام المضادة بواسطة البروتيناز.

تؤدي عملية التنظيف باستخدام الكلوروفورم والفينول (KA phenyl chloroform) إلى إزالة البروتين المهضوم، وتعمل عملية الترسيب على تنقية الحمض النووي DNA، الذي أصبح الآن غنياً بالشظايا المـُمثيلية. يمكن استخدام DNA الناتج في تطبيقات مثل مصفوفة PCR الدقيقة والتسلسل. يتم إجراء هذه العملية عموماً كإجراء يستغرق يومين.

يتضمن اليوم الأول تحضير DNA، والمعالجة بالموجات فوق الصوتية للترسيب المناعي، وهضم البروتين. ويتضمن اليوم الثاني استخلاص الكلوروفورم عند pH محدد والترسيب بالإيثانول لتنقية وعزل DNA المخصب بالميثيل. هناك بعض المواد الخاصة المطلوبة للتنفيذ، بما في ذلك أنابيب طرد مركزي مغلفة بالسيليكون، وجهاز معالجة DNA بالموجات فوق الصوتية، وأجسام مضادة أولية (anti-5-methylcytosine mouse monoclonal antibody)، وأجسام مضادة ثانوية (DynaBeads) مقترنة بـ (sheep anti-US IgG)، وحامل أنابيب مغناطيسي.

تتمثل الخطوة الأولى في بروتوكول Meetup في تحضير الـ DNA. ومن الضروري تقييم طبيعة الـ DNA مسبقاً؛ حيث يلزم معرفة حالة عينة الـ DNA، وما إذا كانت تتكون أساساً من شريط مزدوج أو مفرد، وذلك لأن التقدير الكمي الدقيق للعينة يكتسي أهمية قصوى، كما أن الطرق المختلفة لتحديد كمية الـ DNA قد تتأثر سلباً بوجود أنواع غير مرغوب فيها من الـ DNA.

يمكن تقدير كمية الـ DNA مزدوج الشريط بسهولة عن طريق القياس الطيفي باستخدام NanoDrop 3، حيث يتم تحميل 1.5 µL وضبط نوع القياس على الحمض النووي (nucleic acid)، واختيار DNA 50 كمعامل للحساب، ثم تهيئة الجهاز باستخدام 1.5 µL من الماء. يتم تنظيف القواعد (pedestals) ومعايرة الجهاز (blank) باستخدام 1.5 µL من السائل. وتكون العينة مذابة في السائل، ثم تُنظف القواعد ويُحمل 1.5 µL من العينة ويتم الضغط على زر القياس.

سيتم تحديد التركيز ويمكن استخدامه. ولحساب عدد الميكروليترات المطلوبة، فإن نسبة A260 إلى A280 التي تبلغ 1.8 تعد مثالية هنا. يتم تحضير عينة بتركيز 1 microgram.

ومع ذلك، فإن عينة لا تتجاوز 200 nanograms كافية للحصول على نتائج ناجحة. وللبدء، ضع عينة DNA في أنبوب سيليكوني نظيف. ثم أضف كمية كافية من الماء المعقم لرفع الحجم النهائي إلى 50 µL.

يجب إجراء عملية سونيكة (Sonication) الحمض النووي DNA والترسيب المناعي في أنابيب مُسيليكونة لمنع الارتباط غير النوعي للحمض النووي والبروتينات بجدران الأنابيب. وبمجرد تحضير الحمض النووي DNA، يجب إخضاع العينة للسونيكة؛ حيث إن السونيكة مطلوبة لتجزئة الحمض النووي DNA، نظرًا لأن الترسيب المناعي يكون أكثر كفاءة مع قطع الحمض النووي DNA الأصغر حجمًا. قم بوضع العينة في جهاز السونيكة، وتأكد من ضبط إعدادات الطاقة على الدرجة العالية، وضبط الجهاز على 30 ثانية تشغيل و30 ثانية إيقاف، ثم املأ القاعدة حتى خط التعبئة بماء بدرجة حرارة 4 °C.

قم بإجراء عملية السونكة (Sonicate) للعينة لمدة سبع دقائق. عند الانتهاء من السونكة، أخرج الأنبوب وضعه على الثلج. من المهم تحسين ظروف السونكة مسبقاً وفقاً للعينة المتوقعة وحجم DNA.

على سبيل المثال، ستتطلب عينة DNA متحللة جزئيًا وقتًا أقصر لعملية السونكة. ويمكن تصور نواتج السونكة باستخدام تقنيات الرحلان الكهربائي القياسية. وفي هذه المرحلة، يُراد الحصول على قطع DNA يتراوح طولها بين 300 و1000 زوج قاعدي لاستخدامها لاحقًا.

في اختبارات المصفوفات الدقيقة (microarray) وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يجب الاحتفاظ بخُمس كمية الحمض النووي (DNA) ليكون بمثابة الحمض النووي المرجعي أو المدخل؛ وفي هذه الحالة، سيتم استخدام 800 nanograms من الـ DNA الذي تم تعريضه للموجات فوق الصوتية لعملية الترسيب المناعي، بينما يُجنب المتبقي كـ DNA مرجعي. الخطوة التالية في بروتوكول الوسط هي تفاعل الترسيب المناعي (IP)، وقبل إضافة الجسم المضاد الأولي، يجب تغيير طبيعة الـ DNA (denaturation). وتعد عملية تغيير الطبيعة ضرورية لأن الجسم المضاد الأولي يتأثر بالـ DNA أحادي الشريط.

ضع العينة في حمام مائي عند 95 °C لمدة 10 دقائق. عند اكتمال خطوة المسخ، انقل الأنبوب فوراً إلى الثلج لمدة خمس دقائق على الأقل. سيمنع ذلك الحمض النووي الممسوخ من إعادة الالتواء، مما يسمح بارتباط الأمضاد بشكل مثالي بعد تبريد العينة.

قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لسحب المحتويات إلى القاع. بعد ذلك، يجب إضافة الأجسام المضادة الأولية. كما ينبغي معايرة كمية الأجسام المضادة المستخدمة لكل دفعة ولكل شركة مصنعة.

في هذه الحالة، نضيف 5 µg من الأجسام المضادة الأولية، ثم نضيف منظم الترسيب المناعي أو IP buffer حتى يصل الحجم النهائي إلى 500 µL. بعد ذلك، يوضع DNA المرسب مناعيًا في جهاز تدوير ويترك للتحضين عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. ويعد التدوير ضروريًا لمنع تكتل الأجسام المضادة داخل الأنبوب أثناء عملية التحضين.

قبل حوالي 15 دقيقة من اكتمال حضانة الجسم المضاد الأولي، قم بتنظيف وتحضير حبيبات dyna المغناطيسية. أولاً، أعد تعليق الحبيبات في الأنبوبة جيداً عن طريق الرج الدوامي. ثم انقل 30 µL من الحبيبات إلى أنبوبة سيليكونية نظيفة وضع هذه الأنبوبة على حامل مغناطيسي لتفاعلات متعددة.

انقل 30 µL من الخرز لكل تفاعل، بالإضافة إلى كمية كافية لتفاعل إضافي واحد لتعويض خطأ الماصة أو الفقد غير المقصود لبعض الخرز. على سبيل المثال، بالنسبة لثمانية تفاعلات، اسحب كمية كافية لتسعة تفاعلات أو 270 µL.

سوف تنجذب الخرزات المغناطيسية نحو جدار الحامل المغناطيسي. انتظر لمدة دقيقتين حتى تهاجر الخرزات وتستقر في شكل خط محدد على جدار الأنبوب. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه باستخدام الماصة بعناية، مع التأكد من تجنب تحريك الخرزات الموجودة على الجدار الخلفي بطرف الماصة.

استبدل الطافي بحجم زائد من منظم IP، ثم قم بالرج باستخدام جهاز vortex وأعد الأنبوب إلى الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين. كرر عملية الغسل هذه مرة أخرى، ثم أعد تعليق خرزات الغسل في حجمها الأصلي من منظم IP. استخرج أنبوب العينة من جهاز الدوران (Rotator) عند انتهاء فترة الحضانة.

لإكمال عملية الترسيب المناعي، أضف 30 µL من الحبيبات النظيفة إلى التفاعل وأعد الأنبوب إلى جهاز التدوير لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. وخلال فترة التحضين هذه، سيرتبط الجسم المضاد الثانوي، وهو anti mouse IgG، بالجسم المضاد الأولي للفأر. ترتبط الأجسام المضادة anti mouse بحبيبات dyna المغناطيسية، مما يسمح باستعادة النواتج المرتبطة بسهولة ومن ثم القيام بخطوة التنقية التالية.

بمجرد اكتمال عملية الحضن باستخدام كلا الأجسام المضادة، ضع أنبوب الترسيب المناعي (IP) على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين. في هذه المرحلة، سيكون الحمض النووي المميّث مرتبطاً بالجسم المضاد الأولي، والذي بدوره سيكون مرتبطاً بالجسم المضاد الثانوي المقترن بـ dyna bead. قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه، ثم استبدله بـ 500 µL من محلول الترسيب المناعي (IP buffer).

امزج محتويات الأنبوب وأعده إلى الحامل لمدة دقيقتين. كرر عملية الغسل هذه باستخدام IP buffer مرة أخرى. بعد إزالة الطافي من الغسلة الأخيرة، قم بإعادة تعليق الحبيبات للمرة الأخيرة.

في 400 µL من محلول الهضم المنظم (digestion Buffer)، عـالج التفاعل باستخدام 100 µg من proteinase K وحضنه طوال الليل عند 50 °C. تُعد المعالجة بـ proteinase K ضرورية لهضم بروتينات الأجسام المضادة وأي بروتينات متبقية مرتبطة بالـ DNA، مما يسمح بتحرر الـ DNA الميثيلي في المحلول. يتم إجراء تنقية الـ DNA في اليوم الثاني من إجراء التجميع، استخرج أنبوب الهضم من الحاضنة.

داخل خزانة استخلاص الغازات، أضف 500 µL من الفينول الكلوروفورم بنسبة واحد إلى واحد عند pH 7 إلى الأنبوب، ثم قم بمزجه جيداً باستخدام جهاز الفورتكس. قم بطرد مركزي للأنبوب لمدة 10 دقائق بسرعة 13,000 ×g. أزل الطور المائي العلوي بعناية من الأنبوب دون تعكير الواجهة الفاصلة أو إزالة أي جزء من الطبقة العضوية. انقل الطور المائي إلى أنبوب جديد.

يمكن إجراء عملية استخلاص ثانية إذا ظهر الطور البيني عكراً. بعد ذلك، أضف جزءاً من عشرة من الحجم من خلات الصوديوم بتركيز 3 molar، وفي هذه الحالة، 40 µL. يمكن استخدام 1 µL من الجليكوجين كحامل لتسهيل تنظيف الرواسب.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المرجّ (Vortex) لمزج المحتويات. ثم أضف حجمين من الإيثانول 100%، وقم بالرج ثم التجميد في مجمد عند درجة حرارة -20 °C لمدة 20 دقيقة بعد التجميد. يتم ترسيب DNA المترسب عن طريق الطرد المركزي عند 13,000 G ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

سوف تتكون كتلة من الـ DNA في قاع الأنبوب. استخرج الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وقم بإزالة الإيثانول. احرص على عدم تعكير الكتلة الموجودة في قاع الأنبوب.

قد يكون من الضروري إجراء دورة طرد مركزي قصيرة (pulse spin) لإزالة أي بقايا من الإيثانول. ولغسل الراسب، أضف 500 µL من الإيثانول البارد بتركيز 70%، ثم استخدم جهاز المازج الدوامي (vortex)، وأجرِ عملية الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 دقيقة عند 13,000 G ودرجة حرارة 4 °C. وعند اكتمال الدورة الثانية، قم بإزالة الإيثانول بتركيز 70% عبر دورة طرد مركزي قصيرة، ثم اسحب الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة.

اترك الأنبوب على حامل مع ترك الغطاء مفتوحاً لتجفيف الراسب والسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر. وأخيراً، أعد تعليق الراسب الذي يحتوي فقط على DNA المخصب للمثيلة في 10 µL من الماء المعقم، مع إعطاء وقت كافٍ لإذابة راسب DNA قبل الاستخدام. ومن الممارسات الجيدة التحقق من كفاءة الاستخلاص عن طريق PCR.

يمكن القيام بذلك عن طريق إجراء تفاعلات PCR مصممة لتضخيم نواتج توضح بشكل تفاضلي شظايا DNA الميثيلية وغير الميثيلية باستخدام بادئات تضخيم DNA البشرية الطبيعية. ويمكن استخدام منطقة التحكم في البصمة الجينية H 19 بالتزامن مع بادئات مصممة لتضخيم منطقة من الجينوم غير ميثيلية. ويمكن العثور على أمثلة لتسلسلات البادئات وظروف دورات PCR في البروتوكول المرفق.

عند هذه النقطة، من الضروري استعادة الحمض النووي (DNA) المدخل أو المرجعي الذي تم تجنيبه في بداية بروتوكول التلاقي (meetup protocol). سيتم إعداد مجموعة من تفاعلات PCR باستخدام الحمض النووي المدخل، والمجموعة الأخرى باستخدام الحمض النووي المترسب مناعياً (IP DNA) المخصب بالمثيلة. إذا كان التلاقي ناجحاً، فإن تفاعل IP PCR سينتج ناتجاً باستخدام بادئات المثيلة، بينما لن ينتج أي ناتج باستخدام بادئات التحكم.

وبالعكس، يجب أن ينتج تفاعل PCR المدخل نواتج باستخدام كلا البادئين، حيث إنه يحتوي على قطع DNA ميثيلية وغير ميثيلية على حد سواء. ويمكن استخدام DNA المخصب بالقطع الميثيلية في عدد من التطبيقات اللاحقة، مثل تسلسل PCR وتحليل المصفوفات الدقيقة.

عند دمجها مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى، يمكن استخدامها لاستقصاء حالة ميثيلة الـ DNA في موقع محدد أو على مستوى الجينوم بأكمله لغرض تحديد ملف الميثيلة أو دراسة علم الوراثة فوق الجينية (Epigenomics).