الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي الأب البديل لتحديد الجسيمات النانوية العصبية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف مستشعر حيوي بديل في المختبر لاختبار استجابة الخلايا الدبقية الدقيقة للجسيمات النانوية. سنحدد بعد ذلك السمية العصبية بعد التعرض للوسائط المكيفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المحفزة بالجسيمات النانوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل مدى نشاط فحص الجسيمات النانوية للسمية العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذجنا يوفر القدرة على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة مباشرة وتحديد ما إذا كانت العوامل السرية هي سموم عصبية دون استخدام دراسات القوارض طويلة الأمد باهظة الثمن. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لموت الخلايا الناجم عن الخلايا الدبقية الصغيرة بعد التعرض للجسيمات الدقيقة. يمكن أيضا تطبيقه على نماذج أخرى من الأمراض التنكسية العصبية في سياق اختبار الملوثات البيئية السامة العصبية المحتملة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع خطوة ترشيح وسائط الحالة. لأن كفاءة الترشيح قد تختلف حسب حجم وشكل وتركيز الجسيمات النانوية. في التحضير ، يتم تسخين DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ PSN إلى 37 درجة مئوية.

ثم خذ خلايا الخلايا الدبقية المجمدة BV2 التي تم الحصول عليها من الممرات 18 25 ، وقم بإذابة الثلج بسرعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل الخلايا المذابة برفق إلى قارورة تهوية مساحتها 75 سم مربع تحتوي على 10 مل من الوسط واحتضان القارورة. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط واستمر في نمو الخلايا حتى تصل إلى التقاء 70-80٪ في هذه المرحلة ، قم بشفط الوسط وأضف 500 ميكرولتر من محلول EDTA الدافئ 1 ex trypsin.

بعد السماح للقارورة بالتحضين لبضع دقائق أخرى ، استخدم مكشطة لجمع الخلايا إلى 5 ملليلتر من DMEM الدافئ. ثم قم بتصفية الخلايا من القارورة باستخدام مصفاة 70 ميكرون. كرر هذا الترشيح ثلاث مرات باستخدام نفس المصفاة واجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 مل.

بمجرد تصفيتها ، قم بحساب الخلايا ثم قم بزرع صفيحة سفلية شفافة سوداء الجدران تحتوي على 8000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من DMEM المكملة. بعد 24 ساعة من الحضانة ، استبدل الوسط الموجود في الآبار ب DMEM الخالي من المصل لتجويع الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد 24 ساعة أخرى من الحضانة ، تابع تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة.

للقيام بذلك ، قم أولا بتخفيف جزيئات الفضة النانوية في DMEM الخالي من المصل إلى تركيز العمل المطلوب. ثم استبدل 100 ميكرولتر من الوسط بمركب العلاج. تأكد من تضمين تحكم سلبي في محلول السيارة المخفف بدون الجسيمات النانوية.

استمر الآن في الحضانة لمدة 24 ساعة واستمر في التحليل. للبدء ، اجمع 200 ميكرولتر من الوسط الطافي من كل لوحة جيدا وقم بتحميلها على مرشح يزيل الجسيمات النانوية الموضوعة فوق أنبوب الطرد المركزي الصغير. من المهم أن تتذكر أنه عند تصفية الجسيمات النانوية ، فإن حجمها وشكلها وتركيزها هي عامل لكفاءة الاندماج.

لذلك ينصح باختبار الترشيح مسبقا. الآن قم بتدوير الأنابيب عند 14000 جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم تخلص من التدفق الذي يحتوي على الجسيمات النانوية وضع المرشحات رأسا على عقب في أنابيب تجميع جديدة.

قم بتدوير المرشحات رأسا على عقب عند 1000 جرام لمدة دقيقتين لتجميع وسط مكيف مركز يحتوي على السيتوكينات. بعد ذلك ، قم بزيادة حجم المجموعة إلى 400 ميكرولتر باستخدام DMEM التكميلي الطازج وقم بتخزين الأنابيب على الثلج. لضمان إزالة الجسيمات النانوية المتبقية من الكبريت من الوسائط المفلترة، قم بإعداد معايير الجسيمات النانوية غير المفلترة بنطاق تركيز من فارغ إلى 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر في DMEM الخالي من المصل.

ثم قم بنقل 50 مل من العينات المفلترة وكل معيار في صفيحة سفلية شفافة سوداء الجدران وقياس الامتصاص من 390 إلى 410 نانومتر. لقياس تركيز عامل نخر الورم ألفا في العينات، استخدم نصف حجمها المتبقي في مجموعة متوفرة تجاريا. لهذا الاختبار إنشاء خلايا تحت المهاد من المخزونات المجمدة.

باستخدام نفس الطرق الموصوفة لإنشاء ثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة. استخدمها في النهاية لزرع صفائح سفلية شفافة ذات جدران سوداء تحتوي على 5000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من DMEM المكملة. بعد 24 ساعة من الزراعة ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط واستبدله ب 100 ميكرولتر من الوسط المفلتر والمركز الذي تم جمعه من مزارع الخلايا الدبقية المجهرية المنشطة ثم احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة في ظل الظروف القياسية.

في اليوم التالي ، أضف 22 ميكرولترا من كاشف الريزازورين إلى كل بئر واستمر في الحضانة لمدة 20 دقيقة. ثم باستخدام مقياس الطيف الضوئي متعدد الوضع ، خذ مقياسا للزهور لتقدير صلاحية الخلايا من حيث وحدات التألق النسبية. باستخدام البروتوكول المحدد ، يمكن استخدام وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة كجهاز استشعار حيوي بديل لاستجابة الدماغ للجسيمات النانوية.

زاد إفراز TNF-alfa بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل ملحوظ بعد التعرض للجسيمات النانوية الشظية. عندما تعرضت الخلايا العصبية تحت المهاد لوسط مكيف من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة بالجسيمات النانوية الفضية ، انخفضت صلاحية الخلايا العصبية بشكل كبير. من حيث المبدأ ، أدى التعرض لجزيئات الفضة النانوية إلى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة إلى حالة M1 المؤيدة للالتهابات.

ثم تساهم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تم إطلاقها في موت الخلايا المحيطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة كجهاز استشعار حيوي بديل لاختبار الاستجابة للجسيمات النانوية وما إذا كانت هذه الاستجابة سامة للأعصاب. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاثة أو أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحديد ملامح السيتوكينات المفرزة الأخرى بعد تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة من أجل حالات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة من النمط الظاهري.