تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد إشارة توطين plasmodesmata في البروتينات المستهدفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية من خلال دراسة الروابط بين الخلايا للنباتات من خلال تحديد التفكير النقدي في الإشارات التي توجه البروتينات إلى plasmodesmata ، والتي بدورها تسهل النقل الجزيئي الكبير من خلية إلى خلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الإجراء موثوق به ويمكن تكييفه بسهولة لاكتشاف تسلسل إشارة توطين plasmodesmata في معظم البروتينات المستهدفة بالبلازما ديسماتا.

عرض الفيديو لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم ترشيح الزراعة والتحضير لخطوات المراقبة متحدة البؤر من خلال النشر المطبوع النموذجي. ازرع بذور Nicotiana benthamiana في تربة رطبة وبكثافة عالية. أثناء النمو ، احتفظ بها في غرفة بيئية خاضعة للرقابة عند 20 إلى 25 درجة مئوية وأقل من 16 ساعة من الضوء يوميا ، والتي تحتوي على حوالي 75 ميكرومول من الفوتونات لكل متر مربع في الثانية.

بعد أن يصل قطر u. fil إلى نصف سنتيمتر ، انقل الشتلات بعناية إلى أواني أكبر واستمر في نموها في نفس الغرفة في نفس الظروف. حافظ على النباتات حتى تنمو إلى مرحلة أربع إلى ثماني أوراق في غضون أربعة أسابيع.

في هذه المرحلة ، يجب أن يكون قطر أكبر الأوراق من أربعة إلى ستة سنتيمترات. لسهولة التعرف والتحليل ، اختر نظام تعبير وقم بتمييز كل بروتين معبر عنه بالفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. قم بإعداد بلازميد قائم على pPZP-RCS2 كما هو موضح وأضف ميكروغراما واحدا منه إلى مزرعة 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة من Agrobacterium tumefaciens.

احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتجميد الخلايا في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بتسخين الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط LB إلى خليط الخلية المختص.

بعد إضافة وسط LB ، ضع الخلايا مرة أخرى عند 28 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 3 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.2 مل من وسط LB وقم بوضعها على ألواح أجار LB الانتقائية للمضادات الحيوية.

قم بزراعة الخلايا على الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة حتى تظهر المستعمرات الفردية. بعد ذلك ، قم باختيار العديد من المستعمرات الفردية ووضعها على ألواح أجار LB الطازجة وقم بزراعة الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، خذ كمية صغيرة من البكتيريا من كل لوحة لتحليلها واستخدم Colony PCR لتأكيد وجود التركيبات الثنائية المحددة ذات الأهمية.

أضف كل مستعمرة زراعية مع البناء محل الاهتمام إلى خمسة ملليلتر من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3 ، 000 مرة G.أعد تعليق الحبيبات إلى OD600 من 0.5 في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي.

احتضان التعليق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتحميل اللقاح في حقنة بلاستيكية سعة مليلتر واحد. أمسك ورقة N.Benthamiana الناضجة تماما بإصبع مرتديا قفازا على الوجه المحوري ، واضغط على فوهة المحقنة على البشرة السفلية للورقة. ثم أدخل البكتيريا الزراعية ببطء في وسط التسلل عن طريق حقن الوسط.

حافظ على النبات المتسلل حتى يتم ملاحظته. استخدم شفرة لتقطيع كل ورقة إلى شظايا بين الأوردة بعد 24 إلى 48 ساعة من التسلل. ضع شرائح الأوراق على شريحة الجسم بحيث يكون سطح الورقة متجها لأعلى.

ثم ضع قطرة ماء على شريحة الأوراق وقم بتغطيتها بزجاج الغطاء. قم بتثبيت زجاج الغطاء بقطع صغيرة من الشريط على كل جانب. انقل شريحة إلى المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر واستخدم عدسة ذاتية 10X لتحديد الخلايا ذات أفضل إشارة.

بعد ذلك ، استخدم عدسة ذاتية 63X لتسجيل الصور للحصول على ملاحظات أكثر تفصيلا. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم الفلورسنت المناسب لإثارة البروتينات الفلورية المعبر عنها. احتفظ بجميع الإعدادات المستخدمة للحصول على الصور للحفاظ على الاتساق بين التجارب.

في المتوسط ، افحص 100 إلى 120 خلية لكل حالة تجريبية. تشخيص توطين البروتينات المختبرة باستخدام صور المجهر متحد البؤر. توضح هذه الصور أنماط توطين البلازمودسماتا المحيطية المميزة التي لوحظت لبروتين حركة TMV كامل الطول المدمجة في جزيء الشحن CFP ، ولإشارة توطين البلازمودسماتا المحددة المدمجة في CFP ، وكذلك لبروتين توطين البلازمووديسماتا المعبر عنه المشترك ، PDCB1 المدمجة في DsRed.

في ظل ظروف التحكم ، يظهر استهداف plasmodesmata لبروتين حركة TMV كامل الطول المدمجة في CFP وإشارة التوطين في بروتين حركة TMV المدمجة في CFP ، كما هو موضح هنا مع التوطين الخلوي الفرعي ل CFP والتوطين النووي للعلامة DsRed2. عندما يتحور الحمض الأميني الرابع ، فالين ، إلى ألانين ، يتم فقد بلازما ديسماتا التي تستهدف كل من بروتين حركة TMV كامل الطول وإشارة التوطين المحددة في بروتين حركة TMV. يشير هذا إلى أن هذه البقايا مهمة لهيكل أو وظيفة إشارة توطين plasmodesmata.

بمجرد إتقانها ، يمكن الانتهاء من هذه التقنية في غضون 50 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون النباتات في حالة صحية للغاية وأن النباتات في مرحلة الأوراق الصحيحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد ، ليس فقط لكيفية تحديد إشارة بروتين توطين plasmodesmata ، ولكن أيضا معرفة كيفية تحديد إشارات معينة أخرى في البروتينات النباتية.