سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق الكمي في عملية التمثيل الغذائي لمصادر المغذيات المتعددة باستخدام ركائز مصنفة. يسمح سير العمل هذا بتحديد مصير العناصر الغذائية المستهلكة والأصل الأيضي للمركبات التي تصنعها الخمائر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التمثيل الغذائي الميكروبي مثل كيفية عمل التمثيل الغذائي اعتمادا على الظروف البيئية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتوضيح وقياس بروتين توزيع المغذيات من مصادر متعددة. تم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في استقلاب النيتروجين للخميرة ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على عمليات التمثيل الغذائي والكائنات الحية الدقيقة الأخرى. يكمن مفتاح النجاح في هذه التجربة في قابلية استنساخ التخمير.

يجب على المستخدمين إيلاء اهتمام خاص لجمع الخلايا في نفس المرحلة الفسيولوجية المحددة. سيظهر الإجراء كريستيان بيكو من فريقنا الفني ، بولين سيجينوت ، طالبة دكتوراه من المختبر ، وستيفاني رولرو ، زميلة ما بعد الدكتوراه. في الأوتوكلاف ، قم ببسترة كل وسيط اصطناعي معد لكل مصدر نيتروجين في قارورة سعة لتر واحد تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي.

قم بإذابة الكمية المناسبة من الجزيء المسمى للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب في الوسط. تعقيم الوسيط باستخدام نظام ترشيح فراغي يمكن التخلص منه. باستخدام أسطوانة قياس معقمة ، قسم الوسط بين اثنين من أجهزة التخمير المعقمة مسبقا التي تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي ومجهزة بأقفال تخمير لتجنب دخول الأكسجين مع السماح بإطلاق ثاني أكسيد الكربون.

بعد زراعة سلالة cerevisiae في وسط YPD ، اجمع حصة ما قبل الزراعة تحت التدفق الرقائقي وحدد كمية عدد الخلايا باستخدام عداد جسيمات إلكتروني مزود بفتحة 100 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي للثقافة المسبقة ، قم بتعليق الحبيبات في حجم مناسب من الماء المعقم للحصول على تركيز نهائي 2.5 في 10 إلى 9 خلايا لكل مليلتر. ثم قم بتلقيح كل مخمر بمليلتر واحد من تعليق الخلية.

بعد ذلك ، قم بإعداد منصة تخمير عن طريق تثبيت أجهزة التخمير في أدلة الدعم الموضوعة بشكل صحيح على ألواح التحريك ذات 21 وضعا واضبط معدل التحريك على 270 دورة في الدقيقة. لبدء المراقبة عبر الإنترنت لكل تخمير ، قم بتشغيل تطبيق التحكم في الروبوت ، وانقر فوق الزر "بدء الفحص" وحدد حجم التخمير المراد إجراؤه. للتأكد من أن الواجهة المعروضة تسمح بالإشارة إلى عدد وموضع المخمرات على المنصة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق موقع الفتحة واختر تعطيل لإلغاء تنشيط مراقبة المواضع الفارغة.

لتهيئة برنامج الحساب ، انقر فوق الزر "مهيأ" وتحقق من صحة ذلك باستخدام "موافق". ثم انقر فوق الزر "ابدأ" في تطبيق التحكم في الروبوت لبدء اكتساب الوزن. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي عينتين من سعة ستة ملليلتر مأخوذة من المخمرات عند 2 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. عند الانتهاء ، انقل كل مادة طافية مجمدة إلى أنبوبين وخزنها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.

اغسل كل حبيبات مرتين بخمسة ملليلتر من الماء المقطر واحفظها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لقياس التخصيب النظيري. أضف 200 ميكرولتر من محلول حمض السلفواليسيسيليك بنسبة 25٪ الذي يحتوي على 2.5 ملليمولار نورليوسين كمعيار داخلي إلى 800 ميكرولتر من العينة لإزالة الجزيئات ذات الأوزان الجزيئية العالية. بعد الحضانة والطرد المركزي ، قم بتصفية الخليط من خلال غشاء النيتروسليلوز بحجم المسام 0.22 ميكرومتر وضع العينة في نظام تحليل الأحماض الأمينية.

في برنامج أو برنامج نظام التحليل ، انقر فوق الزر تشغيل لبدء تحليلات الكروماتوغرافيا السائلة باستخدام المحلل المجهز بعمود تبادل الكاتيون. التالى, إعداد مستخلص مؤكسد عن طريق تعليق حبيبات الخلية المسمى المعدة مسبقا في 200 ميكرولتر من حمض الأداء الأدبي. بعد الحضانة لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية ، أوقف التفاعل بإضافة 33.6 ملليغرام من كبريتات الصوديوم.

أضف 800 ميكرولتر من ستة حمض هيدروكلوريك عادي إلى المستخلص المؤكسد ، واحتضان العينة في أنبوب زجاجي مغلق بإحكام لمدة 16 ساعة عند 110 درجة مئوية في فرن جاف الحرارة. بعد السماح للعينة بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 200 ميكرولتر من 2.5 مللي مولر نيورولوسين وقم بإزالة غاز كلوريد الهيدروجين بتيار من النيتروجين. اغسل المستخلص المجفف مرتين ب 800 ميكرولتر من الماء المقطر ، ثم 800 ميكرولتر من الإيثانول.

ثم أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأسيتات الليثيوم 200 مللي مولار إلى المستخلص. حدد التركيزات النسبية للأحماض الأمينية داخل البروتينات في العينة باستخدام الطريقة الكروماتوغرافية الموضحة سابقا. قم بتحلل حبيبات الخلية المسماة بإضافة 1.2 مل من حمض الهيدروكلوريك سداسي المولار واحتضان العينة لمدة 16 ساعة عند 105 درجة مئوية في أنبوب زجاجي مغلق بإحكام في فرن بالحرارة الجافة.

بعد ترك العينة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 1.2 مل من الماء المقطر. بعد الطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوي ، قم بتوزيع المادة الطافية إلى ستة أجزاء سعة 400 ميكرولتر في أنابيب زجاجية مفتوحة. جفف الكسور في فرن على حرارة 105 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات حتى تصل إلى قوام الشراب.

أثناء التحلل المائي للكتلة الحيوية ، جفف الجزء حتى تناسق الشراب عن طريق التحكم المتكرر في حمض التشغيل. من أجل اشتقاق ECF ، قم بإذابة التحلل المائي المجفف المبرد في 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 20 ملليمولار و 133 ميكرولترا من خليط واحد إلى أربعة من البيريدين والإيثانول. أضف 50 ميكرولترا من كلوروفورمات الإيثيل لاشتقاق الأحماض الأمينية.

بعد إطلاق ثاني أكسيد الكربون ، انقل الخليط إلى أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 500 ميكرولتر من ثنائي كلورو ميثان لاستخراج المركبات المشتقة. دوامة العينات لمدة 10 ثوان. بعد الطرد المركزي لمدة أربع دقائق عند 10،000 مرة G، اجمع المرحلة العضوية السفلية لكل عينة باستخدام ماصة باستور وانقلها إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية GC التي تحتوي على ملحق زجاجي مخروطي بحيث يمكن حقن كل عينة مباشرة في أداة GCMS.

تستخدم كواشف اشتقاق HPLC لإجراء ECF. تغيير في كثير من الأحيان ال [كف] كواشف. من أجل اشتقاق DMF-DMA ، قم بإذابة التحلل المائي المجفف في 50 ميكرولتر من الميثانول و 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل.

أضف 300 ميكرولتر من DMF-DMA وقم بتدوير العينة. بعد ذلك ، انقل العينة إلى قارورة أخذ العينات التلقائية GC التي تحتوي على ملحق زجاجي مخروطي الشكل. من أجل اشتقاق BSTFA ، قم بتعليق التحلل المائي في 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل.

أضف 200 ميكرولتر من BSTFA إلى العينة وأغلق الأنبوب الزجاجي بشكل محكم. بعد الحضانة لمدة أربع ساعات عند 135 درجة مئوية ، انقل المستخلص المبرد مباشرة إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية GC التي تحتوي على حشوة زجاجية مخروطية الشكل. الآن ، قم بتحليل العينات باستخدام كروماتوجراف الغاز المجهز بحاقن أخذ العينات الآلي ومقترن بمطياف الكتلة.

انقر فوق أداة في قائمة برنامج الكمبيوتر. ضمن علامة التبويب تسلسل ، انقر فوق تحرير نموذج جدول سجل لإنشاء قائمة نماذج ، وانقر فوق تشغيل وتشغيل التسلسل لبدء الحقن. بعد اكتمال التحليلات ، سجل مجموعة من الشدة لكل حمض أميني يتوافق مع نظائره الكتلية المختلفة.

أضف 10 ميكرولترات من المعايير الداخلية المزيلة المناسبة إلى خمسة ملليلتر من المادة الطافية في أنبوب زجاجي سعة 15 ملليلترا. أضف ملليلترا واحدا من ثنائي كلورو الميثان ، وأغلق الأنبوب بإحكام وقم بهز العينة على منصة هزاز لمدة 20 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، اجمع المرحلة العضوية السفلية في أنبوب زجاجي سعة 15 ملليلترا.

بعد تكرار استخراج ثنائي كلورو ميثان ، جفف المستخلص العضوي أكثر من 500 ملليغرام من كبريتات الصوديوم اللامائية واجمع المرحلة السائلة باستخدام ماصة باستور. تركيز المستخلص بمعامل أربعة تحت تدفق النيتروجين. بعد ذلك ، انقل العينة المركزة إلى قارورة أخذ العينات التلقائية GC.

لقياس GCMS الكمي ، قم بحقن ميكرولترين من العينة بنسبة انقسام 10 إلى واحد ، وافصل الجزيئات المتطايرة المستخرجة باستخدام ملف تعريف درجة حرارة الفرن المناسب. باستخدام جداول البيانات في بروتوكول النص ، أدخل قيم البيانات الأولية التي تتوافق مع تركيز الأحماض الأمينية خارج الخلية ، والوزن الجاف للخلية ، ومحتوى البروتين في الخلايا ، وتركيز الجزيئات المتطايرة ، والإثراء النظاري للأحماض الأمينية البروتينية والجزيئات المتطايرة. يظهر هنا رسم تخطيطي لسير العمل للتحقيق في إدارة الخميرة لمصادر النيتروجين المتعددة الموجودة أثناء تخمير النبيذ.

بالنسبة لنقاط أخذ العينات المختلفة ، تظهر المعلمات البيولوجية قابلية عالية للتكرار بين أنواع التخمير. تظهر هنا نظرة عامة على إعادة توزيع النيتروجين من المصادر الموجودة في عصير العنب إلى جميع الأحماض الأمينية البروتينية. إلى جانب تحديد أرصدة الكتلة ، قدم قياس التخصيب النظاري للأحماض الأمينية البروتينية أول تقدير كمي لمساهمة الأرجينين والجلوتامين والأمونيوم ومصادر أخرى في مجموعات الأمين لكل من هذه المركبات.

تصوير مقارنة بين كمية الأحماض الأمينية المستهلكة التي يتم استردادها مباشرة في الكتلة الحيوية هنا. يظهر هنا تقسيم الأحماض الأمينية الأليفاتية المستهلكة والليوسين والفالين في شبكة التمثيل الغذائي في الخميرة. يتم استرداد أكثر من 96٪ من الفالين والليوسين المستهلكين في منتجات التحويل الخاصة بهم.

والمثير للدهشة أن جزءا كبيرا من الفالين والليوسين يتم تقويضه على الرغم من عدم التوازن الكبير بين توافر هذه المركبات في الوسط ومحتواها في الكتلة الحيوية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في خمسة أيام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد جزء الملصقات من الركيزة بعناية وفقا للقضايا العلمية.

لضمان قابلية التكاثر البيولوجي الجيدة ، قم بإجراء التخمير والتحليل الكروماتوغرافي في نسختين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف كيفية تغير التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء للكائنات الحية الدقيقة اعتمادا على الظروف البيئية. لا تنس أن العمل مع كواشف الاشتقاق ومذيب الأرجينين يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وبالتالي يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل تحت غطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.