أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

الهدف العام من هذه التجربة هو اكتشاف التغيرات في عدم ذوبان البروتين مع تقدم العمر في C.elegans وتقييم كيفية تأثير الضربة القاضية الجينية المستهدفة على علامة الشيخوخة هذه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الشيخوخة والبروتينات مثل سبب فشل الكائنات الحية في الحفاظ على بروتين صحي مع تقدم العمر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي فرصة دراسة تراكم البروتين أثناء الشيخوخة الطبيعية في غياب عمليات المرض.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتجميع البروتين في C.elegans ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفها مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى ، على سبيل المثال لدراسة عدم ذوبان البروتين المرتبط بالعمر في الفأر. لبدء العلاج ، أضف 207.45 مل من الوسائط القاعدية S مع كواشف إضافية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب إلى قارورة ثقافة فيرنباخ سعة 2 ، 800 مل. أضف تركيزا نهائيا قدره 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من كاربينيسيلين ومليمولار واحد من IPTG وأغلق القارورة بغطاء لولبي غشائي

أخرج L1 من حاضنة 25 درجة مئوية وانقلها إلى أنابيب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي L1 عند 1 ، 900 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. بعد الغزل ، قم بإزالة المادة الطافية.

تحت المجهر ، احسب L1 لكل ميكرولتر ومتوسط الأرقام التي تم الحصول عليها من تسع قطرات على الأقل. بعد ذلك ، أضف 50،000 دودة لمجموعة الديدان الصغيرة و 100،000 دودة لمجموعة الديدان القديمة في أربع قوارير لثقافة فيرنباخ تم إعدادها في الخطوة السابقة. ثم أضف بكتيريا RNAi للتحكم وبكتيريا RNAi للجين ذي الأهمية بما يتناسب مع عدد الديدان.

بعد إضافة البكتيريا ، أكمل زراعة الدودة باستخدام S Basal ليصل الحجم الإجمالي إلى 300 ملليلتر. احتضان مزرعة الدودة عند 25 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز بمعدل 150 دورة في الدقيقة حتى التجميع. اجمع الديدان الصغيرة في اليوم الثاني أو الثالث لقياس المستويات الأساسية لقابلية ذوبان البروتين.

صب الديدان من قارورة واحدة في قمع فصل واترك الديدان تترسب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد رواسب الديدان ، افتح قضيب التوقف وقم بتقطير الديدان في أنبوب واحد سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بتقسيم حبيبات الدودة إلى أنبوبين سعة 15 مل.

املأ الأنابيب حتى 15 مل مع M9 والطرد المركزي للديدان. لغسل الديدان ، قم بإزالة المادة الطافية واملأ الأنبوب حتى 15 مل ب M9. كرر الطرد المركزي. بمجرد اكتمال الغسيل ، انقل الديدان إلى أنبوبين سعة 50 مليلتر واستخدم الثلج M9 لملء الحجم الإجمالي إلى 20 ملليلترا.

لإزالة البكتيريا والديدان الميتة ، أضف حبيبات الدودة المخففة سعة 20 ملليلتر إلى أنبوبين سعة 50 مليلتر مملوءين ب 20 مل من السكروز المثلج 60٪. الطرد المركزي بسرعة الأنابيب. باستخدام ماصة سعة 25 ملليلتر ، قم بإزالة ما يصل إلى 15 مل من طبقة الدودة العلوية بعناية.

ضع طبقة الدودة العليا مباشرة في 37 مل من M9 بالإضافة إلى أوكتوكسينول -9 المحضر على الثلج. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2 ، 700 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية تسارع تسعة وتباطؤ سبعة. بعد التخلص من المادة الطافية ، انقل الحبيبات إلى أربعة أنابيب سعة 15 مليلتر واغسلها مرتين باستخدام الثلج البارد M9 بالإضافة إلى أوكتوكسينول -9.

ثم ، قم بالطرد المركزي للأنابيب. قم بإزالة المادة الطافية واملأ الأنابيب حتى علامة 15 مليلتر بالثلج البارد M9 بالإضافة إلى أوكتوكسينول -9. اغسل الديدان بالثلج M9 واجمع الأنابيب الأربعة في أنبوبين.

املأ الأنابيب حتى 15 مل وأجهزة الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية ، واملأ الأنبوبين ب M9 في درجة حرارة الغرفة إلى حجم إجمالي يبلغ أربعة ملليلتر وقم بتدويرهما على خلاط الجوز عند 25 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد الجوز ، اغسل الديدان مرتين بالثلج M9 بالإضافة إلى أوكتوكسينول -9.

ثم اغسلها مرتين باستخدام M9 وانقل الديدان إلى أنبوب واحد. اغسل الديدان في المخزن المؤقت لإعادة التجميع أو استخراج الملح العالي RAB بدون مثبطات قبل الجمع. قم بإزالة المادة الطافية حتى لا يكون هناك سائل فوق حبيبات الدودة.

ثم, قم بتقدير حجم حبيبات الدودة وأضف حجما متطابقا من RAB مع مثبطات. قم بإعداد أنبوب سعة 50 مليلتر نصف مملوء بالنيتروجين السائل على الثلج الجاف وباستخدام ماصة باستور ، اسحب الديدان وقم بتقطيرها ببطء في الأنبوب. اسمح للنيتروجين السائل بالتبخر وتخزين الديدان المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من المعالجة.

قم بتبريد الهاون بالنيتروجين السائل وقم بتعطيل على الجليد الجاف. انقل الديدان المجمدة إلى الهاون المبرد مسبقا وطحنها لمدة 2.5 دقيقة. أضف 100 مل من النيتروجين السائل إلى المسحوق وطحنها لمدة 2.5 دقيقة أخرى.

استخدم مجهرا للتحقق من أن أجسام الدودة مقسمة إلى قطع صغيرة. ثم انقل المسحوق إلى أنبوبين مليلتر وخزنهما عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. على الجليد الجاف ، قم بوزن 350 ملليغرام من الديدان المطحونة مرتين لكل نقطة زمنية ولكل بكتيريا RNAi في أنبوبين مليلتر.

لإزالة البروتينات عالية الذوبان في الملح ، أضف مجلدين لكل وزن من RAB المحضر بالفعل مع مثبطات ، ومليمولي PMSF واحد ، و 200 وحدة لكل مليلتر DNase I ، و 100 ميكروغرام لكل مليلتر RNase A لكل أنبوب وقم بإذابة المسحوق على الجليد. ارسم التعليق في حقنة سعة مليلتر واحد 15 مرة واحتضنه على الجليد لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 18 ، 400 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

اذهب من خلال الطبقة الدهنية واجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات عالية الذوبان في الملح في أنبوب واحد سعة ملليلتر لكل حالة. قم بإزالة الدهون والتخلص منها. Aliquot البروتينات عالية الذوبان في الملح للتجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

للتخلص من الدهون ، قم بإذابة الحبيبات ب 700 ميكرولتر من RAB مع مثبطات تحتوي على سكروز مولي واحد بدون DNase I و RNase A. ارسم المعلق في حقنة 10 مرات واحتضانه على الجليد لمدة خمس دقائق. تأكد من إزالة جميع المواد الطافية والدهون والتخلص منها. لإزالة البروتينات القابلة للذوبان في SDS ، قم بإذابة الحبيبات ب 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPA.

ارسم التعليق في حقنة 10 مرات واحتضانه لمدة 10 دقائق على الثلج. جهاز طرد مركزي عند 18 ، 400 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان في SDS وحصة للتجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قم بتجميع عينتين من كل حالة معا بعد إذابة كل حبيبات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA وارسم التعليق في حقنة 10 مرات. احرص على إزالة كل المادة الطافية والتخلص منها. قم بإذابة الحبيبات النهائية التي تحتوي على بروتينات عالية غير قابلة للذوبان مع 400 ميكرولتر 70٪ حمض الفورميك ورسم المعلق في حقنة 20 مرة.

احتضان التعليق لمدة 20 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي التعليق في أنابيب الطرد المركزي الفائق لإزالة حطام بشرة الدودة. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات عالية غير قابلة للذوبان وقم بتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

كشف تلطيخ البروتين الكلي لمحتوى البروتين غير القابل للذوبان في الديدان الصغيرة والمسنة عن زيادة قوية مرتبطة بالعمر في مستويات البروتين غير القابلة للذوبان بدرجة عالية في الضابطة وليس في طويلة العمر. أكد تلطيخ الأجسام المضادة ل PAB-1 ، وهو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبي مع مجال متوقع يشبه البريون ، بيانات قياس الطيف الكتلي التي حافظت طويلة العمر على قابلية الذوبان PAB-1 مع تقدم العمر. تم إجراء تحليل في الجسم الحي للحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن tagRFP PAB-1 في عضلات البلعوم.

في الصغيرة ، كان tagRFP PAB-1 موجودا بشكل أساسي في جميع أنحاء البلعوم. مع تقدم العمر ، تراكم تدريجي في النقاط الساطعة تبدأ في البصلة البلعومية الخلفية. أثناء الشيخوخة ، لاحظنا أيضا تجميعا في البصلة البلعومية الأمامية في عدد متزايد من.

يكشف القياس الكمي لمستويات تجميع tagRFP PAB-1 المختلفة مع العمر في النوع البري والخلفية المتحولة daf-2 عن تأخير شديد في تجميع tagRFP PAB-1 مع تقدم العمر في طويلة العمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع عدد كبير من الديدان لاستخراج البروتين وكيفية عزل المجاميع الكبيرة غير القابلة للذوبان بدرجة عالية لمزيد من التحليل عن طريق قياس الطيف الكتلي أو صفحة SDS.