ديسيلولاريزيشن ومنهجية ريسيلولاريزيشن للاوردة الصافن البشرية

تشرح هذه الطريقة إجراء مفصلا لهندسة أنسجة الأوردة الصافنية. نوضح أيضا إعداد إعدادات إزالة الخلايا والمفاعل الحيوي لإعادة الخلايا باستخدام جهاز بسيط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن عينة دم بسيطة مطلوبة لإعادة الخلايا ، وبالتالي القضاء على جمع نخاع العظم المؤلم وإجراءات زراعة الخلايا التي تستغرق وقتا طويلا.

للحصول على تروية وغسيل Triton-X 100 ، قم بإعداد إعداد إزالة الخلايا أولا. إلى غرفة سعة لترين ، قم بلصق جميع القطع الثلاث من الأنبوب A.Tape أنبوب واحد على الحائط حيث تلامس الحافة الجزء السفلي من الغرفة لمدخل المنظف. قم بلصق الأنبوبين الآخرين على الجدار المقابل بمسافة تتراوح من خمسة إلى 10 سم بينهما ، اعتمادا على طول الوريد.

يجب أيضا لصق ما لا يقل عن خمسة سنتيمترات من هذه الأنابيب على أرضية الغرفة. قم بتوصيل أنبوب مدخل المنظف بالأنبوب B باستخدام موصلات الإغراء من الذكور والإناث. ثم قم بتوصيل الأنبوب B بالأنبوب F ، والأنبوب F بالأنبوب C.

الآن ، ضع الأنبوب F في كاسيت المضخة التمعجية. خذ أنبوبا آخر C وقم بتوصيل أحد طرفيه بمخرج الوريد. ضع الطرف الآخر في وعاء زجاجي مزود بمخرج خرطوم سفلي وموضوعه على ارتفاع 45 سم فوق الغرفة ، وقم بلصقه لتثبيته.

هذا بمثابة منفذ المنظفات. بعد ذلك ، ادفع أحد طرفي الأنبوب G في مخرج خرطوم البرطمان الزجاجي ، وضع الطرف الآخر في حجرة الوريد. بعد ذلك ، قم بإعداد إعداد إزالة الخلايا الثاني لتروية TnBP كما هو مفصل في بروتوكول النص.

قم أيضا بإعداد إعداد إزالة الخلايا ثلاثة لتروية الحمض النووي كما هو مفصل في النص ، وضعه عند 37 درجة مئوية. لتحضير المفاعل الحيوي لإعادة الخلايا ، أدخل الأنبوب H في منفذ واحد من غطاء رباعي المنافذ ليكون بمثابة مخرج الوريد. في المنفذ الثاني ، أدخل الأنبوب I ليكون بمثابة مدخل الوسائط.

وفي المنفذ الثالث ، أدخل الأنبوب J لمدخل الوريد. بعد ذلك ، أدخل الطرف الآخر من الأنبوب H في المنفذ الرابع ليكون بمثابة منفذ الوسائط. قم بتوصيل موصلات التخفيض بالنهايات الداخلية للأنابيب H و J.ثني الطرف الآخر من الأنبوب J على شكل U واربطه بخياطة.

الآن ، ضع أنبوبا سعة 60 مليلتر بقاعدة مسطحة في زجاج سعة 250 مل. بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب K بمدخل الوريد وقم بتوصيل الطرف الآخر بالأنبوب E.Connect الأنبوب E بأنبوب ثان K ، ثم بمدخل الوسائط. ثم ضع إعداد الغطاء المجهز في الأنبوب الموجود في الزجاجة.

أخيرا ، قم بتعقيم المفاعل الحيوي عن طريق التعقيم. قم بإجراء دورتين للتجميد والذوبان على الوريد الصافن البشري كما هو مفصل في بروتوكول النص قبل قطع خزعة بطول ملليمترين بالمقص. ثبت الخزعة في الفورمالديهايد لمدة 24 إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

اربط كل طرف من طرفي الوريد بانتقادات لاذعة من موصل إغراء ذكر وإناث بخياطة. قم بتوصيل الوريد بإعداد إزالة الخلايا واحد واملأ الغرفة بلتر واحد من المحلول الثاني. الآن ، قم بتفريغ لمدة 15 دقيقة بمعدل 35 مل في الدقيقة وأفرغ محتويات الإعداد.

ثم أضف لترا واحدا من المحلول أربعة وقم بتسخينه لمدة أربع ساعات بمعدل 35 مل في الدقيقة. أفرغ المحتويات ، وأضف 500 مل من المحلول الثاني ، ثم قم بإفراغ المحتويات لمدة خمس دقائق ، ثم أفرغ المحتويات مرة أخرى. افصل الوريد عن إعداد التروية الأول ، وقم بتوصيله بإعداد التروية الثاني.

بعد ذلك ، أضف لترا واحدا من المحلول خمسة ، وقم بتشغيل النمام ، وقم بتثبيته لمدة أربع ساعات بمعدل 35 مل في الدقيقة. افصل الوريد عن إعداد التروية الثاني ، واغسل الوريد من الخارج مرتين ب 20 مل من الماء عالي النقاء. ثم استخدم حقنة لغسل الوريد من الداخل مرتين ب 20 مل من الماء فائق النقاء لمدة خمس إلى 10 دقائق.

بعد الخروج مع إعداد التروية ثلاثة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتوصيل الوريد بإعداد التروية الأول. املأ لترا واحدا من المحلول الثاني وقم بتسخينه طوال الليل بمعدل 35 مل في الدقيقة. كرر عملية التروية أربع مرات للإزالة الكاملة للمواد النووية.

بعد التروية ، قم بإفراغ الإعداد ، واملأ لترا واحدا من المحلول الثاني ، وقم بتسخينه لمدة 24 ساعة بمعدل 35 مل في الدقيقة. بعد 24 ساعة ، أفرغ الإعداد مرة أخرى واملأه بترا واحدا من الماء عالي النقاء. Perfuse لمدة 24 ساعة أخرى بمعدل 35 مل في الدقيقة.

أخيرا ، كرر التروية باستخدام نفس الظروف ولكن مع المحلول السابع. بعد التحقق من إزالة الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتعقيم الوريد عن طريق وضعه في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 50 مل من المحلول الثامن. حرك بمعدل 80 دورة في الدقيقة في شاكر لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

العمل في خزانة التدفق الصفحي للحفاظ على العقم ، استخدم الآن ملقطا معقما لنقل الوريد المعقم إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على 50 مل من المحلول المعقم سبعة ، يحتوي على 500 ميكرولتر من مضاد مضاد. حرك الوريد كما كان من قبل لمدة 12 ساعة ، وقم بتغيير المحلول السابع مرتين على الأقل بينهما. باستخدام ملقط معقم ، انقل الوريد إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر ، وأضف 50 مل من الوسائط البطانية ، وقم بتحريكه لمدة 11 ساعة.

الآن ، قم بتوصيل الوريد عن طريق ربطه بمدخل ومخرج وريد المفاعل الحيوي بخياطة وملقط معقمة ، وشد إعداد الغطاء بالزجاجة سعة 250 مل. املأ المفاعل الحيوي بنفس الوسط البطاني. أضف الهيبارين بمعدل 50 وحدة لكل مليلتر وقم بتثبيته لمدة ساعة بمعدل ملليلترين في الدقيقة في الحاضنة.

اجمع 15 إلى 25 مل من الدم الطازج من المتبرع في أنابيب فراغ مغلفة بالهيبارين وقم بتخفيفه واحدا إلى واحد بمحلول ستين. في وقت لاحق ، أضف عامل النمو البطاني الوعائي المشتق من الغدة الصماء ، وعامل نمو الانفجار الليفي الأساسي ، وحمض الساليسيليك الخفي. بعد إفراغ الوسط البطاني من المفاعل الحيوي ، أضف الدم فيه وقم بتسخينه لمدة 48 ساعة بمعدل ملليلترين في الدقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

بعد حوالي 12 ساعة ، اعمل في خزانة التدفق الصفحي لإزالة قطرة دم من المفاعل الحيوي وقياس الجلوكوز باستخدام جهاز مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم. إذا كان المستوى أقل من ثلاثة ملليمول لكل لتر ، أضف الجلوكوز لجعله في حدود سبعة إلى تسعة ملليمول لكل لتر. بعد 48 ساعة من العودة إلى الحاضنة ، قم بتصريف الدم من المفاعل الحيوي في خزانة التدفق الصفحي.

أضف 30 مل من المحلول المعقم سبعة ، وقم بتثبيته لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتصريف المحلول. كرر هذه العملية حتى يفقد اللون الأحمر الدموي. أخيرا ، أضف 30 إلى 45 مل من الوسط البطاني وقم بتثبيته لمدة 96 ساعة في الحاضنة بمعدل ملليلترين في الدقيقة.

افصل الوريد المعاد خلوته عن المفاعل الحيوي في خزانة التدفق الصفحي ، وقم بقطع حواف الوريد بخمسة ملليمترات باستخدام المقص ، وتخلص منها. خذ خزعة كما كان من قبل ، وضعها في الفورمالديهايد ، وقم بالتحقق من إعادة الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. يبدو التشكل الإجمالي للوريد الطبيعي أحمر فاتح اللون.

يضيع اللون الأحمر في دورات إزالة الخلايا التدريجية ، وبعد خمس دورات من العلاج ، يبدو شاحبا وأبيض. بدا الوريد الذي تم إعادة خلته عن طريق نضح الدم المحيطي والوسط البطاني مرة أخرى أحمر فاتح اللون. تظهر هنا صورة تلطيخ الهيموتوكسيلين والإيوسين التمثيلية للوريد الطبيعي تظهر وجود العديد من النوى الزرقاء.

ومع ذلك ، لم يتم رؤية النوى الزرقاء في تلطيخ الهيموتوكسيلين والإيوسين للوريد منزوع الخلايا. في الوريد المعاد خلويته المليء بالدم والوسط البطاني ، أظهر تلطيخ الهيموتوكسيلين والإيوسين وجود ارتباط خلوي في التجويف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء إزالة الخلايا من الوريد الصافن بواسطة المنظفات وإعادة الخلايا بالدم المحيطي والوسط البطاني.

تقنية إزالة الخلايا هذه باستخدام نضح Triton-X 100 و TnBP والحمض النووي تحت الضغط ناجحة وقابلة للتكرار في إزالة النوى من الأوردة الصافنة البشرية. على الرغم من أن هذه التقنية تستغرق 20 يوما حتى تكتمل ، إلا أن تخزين الوريد منزوع الخلايا كمنتج ما بعد الرف سيقلل من وقت الإجراء إلى ثمانية أيام. يمكن اعتبار إعادة خلية الأوردة باستخدام الدم المحيطي للمتلقي ذات صلة سريريا.

أظهر إعادة خلية الوريد ببروتوكول مماثل وعدا في الزرع السريري من خلال توفير إمدادات دم وظيفية بعد العملية. مع تعديلات طفيفة ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لأي نوع من أنواع الأوردة ، وكطعم شخصي في العيادات لجميع جراحات الأوعية الدموية.