الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

طريقة التهجين الجزئية هذه مفيدة لمقارنة عدد كبير من العينات من كائن حي مع جينوم معروف. مقارنة مع نهج تسلسل الإنتاجية عالية ، وكمية البيانات التي تولدها هذه الطريقة هو أسهل بكثير للتعامل معها ، ويمكن تحليلها بطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة. وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور كريستيان سيلر عالم ما بعد الدكتوراه العامل في مجموعة البحوث في Rosis في IPK في Gatersleben.

قبل تنفيذ التهجين microarray باستخدام مجموعة التهجين التعبير الجيني، وإعداد وكيل حظر 10X وفقا لمواصفات الشركة المصنعة و aliquot وكيل الحجب الناتجة في 200 وحدات التخزين ميكرولتر. ثم، تخزين عامل حظر في ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخدام. في يوم التهجين microarray، ذوبان واحد 200 ميكرولتر aliquot من عامل منع 10X على الجليد وprewarm فرن التهجين إلى 65 درجة مئوية وكتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية.

إعداد مزيج التفتيت لكل عينة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة وخلط العينات بلطف على دوامة. بعد دوامة، تدور لفترة وجيزة أسفل العينات في الطرد المجهري قبل احتضان لمدة 30 دقيقة بالضبط في كتلة الحرارة 60 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، على الفور تبريد كل أنبوب على الجليد لمدة دقيقة واحدة قبل وقف التجزئة مع 25 ميكرولترات من 2X الجينات التعبير العازلة التهجين، الثورات عالية في الدقيقة لكل أنبوب.

تخلط مع الأنابيب لطيف، مع الحرص الشديد على عدم إدخال أي فقاعات، وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في درجة حرارة الغرفة المحيطة. في نهاية دورة مكان على الفور كل من أنابيب على الجليد وتحميل كل عينة في الشريحة microarray في أسرع وقت ممكن. بعد ذلك ، الاستغناء ببطء 44 ميكرولترات من كل مزيج التهجين في وسط كل بئر طوقا ، مع الحرص على تجنب إدخال الفقاعات ، وإضافة 44 ميكرولترات من العازلة التهجين في أي آبار غير مستخدمة.

ضع الشريحة على الفور في الاتجاه الصحيح في أعلى شريحة طوقا، مع الحرص على عدم تسرب أي سائل، وإغلاق الجمعية التهجين بإحكام. تدوير الجمعية لتأكيد عدم وجود فقاعات الهواء الثابتة ووضع الجمعية غرفة التهجين في الدوار فرن التهجين. تعيين سرعة دوران إلى 10 الثورات في الدقيقة الواحدة، ثم بدء التهجين في 65 درجة مئوية لمدة 17 ساعة بالضبط.

في حين أن العينات هي التهجين، وإعداد ثلاثة جمعيات غسل طبق في مخازن الغسيل المناسبة كما هو مبين في الجداول. بعد 17 ساعة بالضبط من التهجين ، تفكيك غرفة تهجين واحدة على مقعد مختبر مبطن بورق مجاني من الوبر ونقل شطيرة صغيرة واحدة إلى طبق يحتوي على عازلة غسيل واحدة مع الباركود الصغير الذي يواجه في وضع مائل دون غمر الشريحة بأكملها في الحاجز. باستخدام ملقط، وفصل الشرائح الزجاجية اثنين والسماح للشريحة طوقا قطرة بلطف في الجزء السفلي من الطبق مع الحفاظ على قبضة ثابتة على الشريحة microarray.

رفع ببطء الشريحة microarray جانبية لنقل فوري في الرف microarray في الطبق الثاني مع الحد الأدنى من التعرض للهواء. عندما تم وضع جميع الشرائح الثمانية بالتساوي على طول الرف، إرفاق حامل حامل ونقل كامل طبق الإعداد اثنين إلى المحرك المغناطيسي. يُحرّك الإعداد بلطف لمدة دقيقة واحدة بالضبط.

في حين يتم تحريك العينات، نقل الطبق الثالث من حاضنة 37 درجة مئوية على مُحرك مغناطيسي ثانٍ. ثم إضافة بلطف 37 درجة مئوية غسل العازلة اثنين لطبق ثلاثة دون تشكيل فقاعات. في نهاية الحضانة التحريك، بلطف وببطء نقل رف الشريحة إلى طبق ثلاثة وإزالة حامل الحامل.

بعد التحريك لمدة دقيقة واحدة بالضبط، ببطء وبلطف إزالة رف الشريحة من الطبق واستخدام ورقة مجانية الوبر لتجفيف بعناية كلا الجانبين من كل شريحة، ووضع كل شريحة في مربع الشريحة كما هو المجفف. بعد السماح للشرائح لتجف لمدة 15 دقيقة، نقل كل شريحة microarray إلى حامل شريحة مع الباركود التي تواجه لأعلى وتحميل أصحاب الشريحة المجمعة في مسح الزّاقة والتسلسل وفقاً لرقم الباركود. ثم، على الفور مسح الشرائح.

في هذا الرقم، تظهر نتيجة تمثيلية من تشغيل لاختبار نوعية استخراج الحمض النووي الريبي. في التحليلات النموذجية للعينات منخفضة محتوى النشا، مثل أوراق الشعير، أربطة رنا ريبوزومية إضافية من الكلوروبلاستات واضحة. ارتفاع عينات محتوى النشا، مثل بذور الشعير، معرض 18 و 28S رنا الريبوسومي.

لاحظ أنه لا يمكن حساب قيمة رقم تكامل RNA الآلي للأنسجة النباتية الخضراء، مثل عينات الأوراق، بسبب الحمض النووي الريبي الريبي الريبوزوكال بالكلوروبلاست. في هذا التحليل التمثيلي، تم إجراء إعداد الحمض النووي الريبي والتهجين إلى رقاقة الشعير الصغير المخصصة كما هو موضح. تعرض الشبكة مثالاً للإشارات المشتقة من كل ركن من الرقاقة، بما في ذلك الخلفية والتموج في نقاط القراءة المستخدمة للمعايرة.

يشير الرسم البياني إلى انحراف النقاط القابلة للكشف مع كثافة الإشارة الخاصة بها. كما لوحظ، يعطي التهجين الناجح منحنى واسع على شكل غاوسي مع القيم المتطرفة الثانوية فقط. يظهر هنا تقرير مراقبة الجودة للإشارات المكتشفة.

يتم إعطاء قيم الشريحة المهجّنة في العمود الثاني ويتم عرض نطاق القيم المقبولة في العمود الرابع. ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة أي إعداد تجريبي لأي كائن حي تتوفر فيه معلومات جوهرية عن الجينوم. استخدام هذه التقنية في مختبرنا مكنتنا من مقارنة وتحليل التغيرات النسخية في الأرز والشعير التي تحدث بعد تحريض الإجهاد النمو.