وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج الحمض النووي الريبي عالي النقاء من بذور النبات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الحبوب ، مثل فهم ملفات تعريف الجينات ، التي تحتوي على النصوص الأصلية في البذور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الباحثين قادرون على إعداد الحمض النووي الريبي عالي النقاء مع تعديل طفيف على الطريقة القائمة على عمود الدوران.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الكمية العالية من الزيوت والبروتينات والكربوهيدرات والبوليفينول في المنخل الأمامي تجعل من الصعب عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء. سيوضح الإجراء كازومي هيكينو ، فني من مختبرنا. لبدء التجربة ، أضف وزنا واحدا بالمائة لكل حجم من درجة البيولوجيا الجزيئية PVP إلى المخزن المؤقت لتحلل الخلية لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وقم بدوامة الخليط بقوة. احتضن PVP لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية لإذابته تماما.

بعد 20 دقيقة من الحضانة ، امزج المخزن المؤقت برفق عن طريق قلب الأنبوب رأسا على عقب لمنع تكون الفقاعات. احصد الثمار من نباتات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا وضعها في أنبوبين من البولي بروبلين مقاس 1.5 ملم على الثلج ، ثم ضع الثمار على ألواح ألومنيوم محفوظة عند أربع درجات مئوية وعزل البذور عن الثمار تحت مجهر ستيريو. بعد ذلك ، ضع ما يقرب من 200 بذرة معزولة في أنابيب بولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر تم تخزينها مسبقا في رف من الألومنيوم على الجليد ، ثم ضع الأنابيب على الفور في النيتروجين السائل.

قم بإزالة الأنابيب من النيتروجين السائل وأعدها إلى رف الألمنيوم على الجليد. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PVP بنسبة واحد بالمائة إلى كل أنبوب وقم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 1000 مرة G، عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بتجانس العينة بمدقة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام مطحنة محرك لمدة 60 ثانية مع إبقاء الأنبوب في رف الألمنيوم على الجليد ؛ بعد ذلك ، أضف 550 ميكرولترا من المخزن المؤقت PVP بنسبة 100٪ واقلب الأنبوب برفق رأسا على عقب لخلط الأنبوب واحتضانه.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للمحلول ثم انقل 550 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين جديد 1.5 ملم وجهاز الطرد المركزي للطاف. انقل 450 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين جديد مقاس 1.5 ملم. استخدم المادة الطافية كمحاللة للخلية لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا.

قم بإعداد رف من الألومنيوم على الثلج ، وقم بإذابة مزيج الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق النقر برفق ، ثم ضع الأنبوب على الرف. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير. ثم قم بتخفيف إجمالي الحمض النووي الريبي في الماء الخالي من RNase.

قم بإذابة إجمالي الحمض النووي الريبي ومجموعات المخزن المؤقت من المجموعة التجارية ، واحتفظ بالإنزيمات من المجموعة على الجليد بعد النقر اللطيف. قم بإعداد أنابيب بولي بروبيلين معقمة خالية من النوكلياز 0.2 ملليلتر للتحليل اللاحق. على الجليد ، اجمع بين خمسة ميكرولترات من إجمالي الحمض النووي الريبي ، وميكرولتر واحد أو 50 ميكرومولار من أوليغو DT التمهيدي وميكرولتر واحد ، أو 50 ميكرومولار عشوائيا ستة مير في أنبوب البولي بروبيلين سعة 0.2 ملليلتر.

احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم ضع الأنبوب على الثلج. اضبط تركيزات البلازميد لقوالب الحمض النووي للمنحنيات القياسية. بعد ذلك ، قم بتخفيف محاليل CDNA من واحد إلى 100 بالماء المقطر ، ثم أضف ميكرولترين من محاليل CDNA المخففة والبلازميدات المعدة مسبقا للمنحنيات القياسية إلى المزيج الرئيسي من مجموعة PCR الكمية في الوقت الفعلي.

أخيرا ، قم بإعداد PCR في الوقت الفعلي وأدخل العينات. تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من حوالي 1,000 بذرة باستخدام تركيزات متفاوتة من المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، PVP. توضح كميات ونقاء الحمض النووي الريبي المعزول أن 1.0٪ PVP هو التركيز الأكثر فعالية لعزل كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المنقى من البذور.

أظهرت التركيزات ، نسب A260 و A280 ، ونسب A260 A230 من الحمض النووي الريبي المعزولة من 200 بذرة أن هذه الطريقة كانت الأفضل في عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء من ثمانية و 12 يوما بعد الإزهار ، أو بذور DAF. على الرغم من أن كميات النصوص المجعدة والمعتمدة على السكر منخفضة نسبيا في تطوير البذور ، إلا أنه كان من الممكن اكتشاف تغيرات التعبير بين البذور في مراحل النمو المختلفة عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. هذه الطريقة مناسبة أيضا للبذور الزيتية الأخرى ، كما هو موضح في هذا الجدول. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا النبات لاستكشاف ملامح التعبير الجيني بتركيز عال من الاحتياطيات المخزنة ، مثل البذور والفواكه.