مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية

يرتبط تنظيم الإشارات المعقدة eIF4F بزيادة ترجمة المجموعة الفرعية mRNA التي تشارك في انتشار السرطان والبقاء على قيد الحياة. نصف هنا فحوصات تفاعل البروتين والبروتين القائمة على الخلية eIF4E-eIF4G والتي تمكننا من تقييم الاضطراب الناجم عن الدواء في سلامة معقدة eIF4F في الخلايا الحية. هناك اهتمام متزايد بتطوير الطرائق التي تستهدف بكفاءة واجهة البروتين والبروتين.

لقد تصورنا أن فحوصات eIF4E-eIF4G PPI الخاصة بنا ستساعد في تعزيز هذه الاستراتيجيات والتحقق من صحتها. سيوفر هذا الاختبار مخططا أوليا مثاليا له لقيادة تحسين مثبطات eIF4E-eIF4G. يعد بذر الخلية بشكل صحيح وإجراء نقل النقل من أكثر الجوانب تحديا في هذا المنتج لأنها قد تنعكس بشكل مباشر على قمع نظام الإبلاغ عن PPI.

بعد إذابة الخلايا وعدها ، قم بزرع 6 ألواح آبار تحتوي على خلايا HEK 293 ، باستخدام 2 مل من وسط النمو القياسي لكل بئر. في صباح اليوم 2 ، لكل تعداء مخطط ، قم بتخفيف 9 ميكرولترات من المحلول القائم على الجسيمات الشحمية في أنبوب يحتوي على 125 ميكرولترا من وسط المصل المختزل بدون الفينول الأحمر. بينما تحتضن الجسيمات الشحمية المخففة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، قم بإعداد المزيج الرئيسي للحمض النووي عن طريق تخفيف 3 ميكروغرام من كل بلازميد في 125 ميكرولتر من وسط المصل المخفض لكل أنبوب تعداد.

أضف 12 ميكرولترا من الكواشف المحسنة إلى مزيج الحمض النووي الرئيسي 2 ، ثم اخلطه جيدا. أضف هذا الخليط على الفور إلى كل أنبوب من الجسيمات الشحمية المخففة بنسبة 1 إلى 1. بعد احتضان مركب دهون الحمض النووي هذا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، أضف المركب إلى كل بئر من 6 ألواح آبار.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في صباح اليوم 3 ، اشطف كل بئر ب 1 مليلتر من PBS ، وأضف 0.3 مل من التربسين. احتضن الألواح على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

بعد الحضانة ، قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 2 ملليلتر إلى كل بئر من وسط المصل المخفض بدون الفينول الأحمر. انقل الخلايا المنقولة إلى أنبوب سعة 15 مل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 290 × جم لمدة 5 دقائق.

شفط الوسط ، وأعد تعليق بيليه الخلية في 2 ملليلتر من وسط المصل المخفض. قم بزرع خلايا HKE 293 المنقولة في ألواح غير شفافة ذات 96 بئرا ، بكثافة 30،000 خلية لكل بئر في 90 ميكرولتر من الوسط. للحصول على 3 مكررات تقنية ل 3 مركبات مختلفة في نفس التجربة ، قم بزرع 60 بئرا.

استبعد الآبار على الحواف. مباشرة بعد بذر الخلايا المنقولة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول مركب DMSO بنسبة 10٪ إلى كل بئر. قم بإعداد محاليل مخزون مركب 1 مللي مولار عن طريق إذابة كل مركب ذي أهمية في 100٪ DMSO.

من أجل الحصول على 3 مكررات لكل معايرة مركب ، استخدم 8 ميكرولتر من محلول المخزون المركب 1 مللي مولار. قم بإجراء تخفيف تسلسلي مزدوج لكل محلول مركب مخزون في 8 آبار من لوحة PCR سعة 96 بئرا عن طريق سحب 4 ميكرولترات من مخزون 1 مللي مولار إلى 4 ميكرولترات من 100٪ DMSO لكل نقطة معايرة بالتحليل الحجمي. تخلص من 4 ميكرولتر الزائدة بعد النقطة الأخيرة من التخفيف التسلسلي المزدوج.

أضف 36 ميكرولترا من الماء المعقم من درجة HPLC إلى كل أنبوب لتحضير 40 ميكرولترا من محاليل التخفيف التسلسلي المركبة 10x في 10٪ DMSO. أيضا ، قم بإعداد عنصر تحكم. 10٪ DMS حل مخزون فقط في المياه المعقمة من الدرجة HPLC.

أضف 10 ميكرولترات من محاليل العمل 10x إلى الخلايا الموجودة في الصفيحة المعتمة المكونة من 96 بئرا من أجل الحصول على التركيز النهائي المقصود ، مع تركيز DMSO المتبقي بنسبة 1٪ احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 ساعات. بعد 3 ساعات ، ابدأ في تحضير كاشف الركيزة لوسيفيراز عن طريق الجمع بين حجم واحد من الركيزة مع 19 مجلدا من كاشف التخفيف. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 25 ميكرولترا من كاشف الركيزة على الفور إلى كل بئر من لوحة البئر 96 مع الخلايا.

رج اللوحة على شاكر مداري بسرعة 350 دورة في الدقيقة ، لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتقييم اللمعان ، ضع اللوحة على قارئ لوحة. اضبط قارئ المرآة على اللمعان ومرشح الانبعاث على 455.

استخدم ارتفاع قياس يبلغ 6.5 ملم مع وقت قياس 1 ثانية. لتقييم صلاحية الخلية ، أضف 33 ميكرولترا من كاشف فحص الجدوى إلى كل بئر. بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتقييم اللمعان باستخدام قارئ اللوحة عن طريق ضبط قارئ المرآة على اللمعان ومرشح الانبعاث على 600.

استخدم ارتفاع قياس 6.5 ملم ووقت قياس 1 ثانية. استخدم البيانات من قارئ اللوحة لتحديد قيمة IC 50 لكل مركب ، عن طريق ملاءمة البيانات مع معادلة منحنى التركيب المكونة من 4 معلمات الموضحة في المخطوطة. تم نقل خلايا HEK 293 باستخدام نظام تكميل eIF4E-eIF4G ، ثم انحسرت ومعالجتها بمثبطات mTOR.

عندما تم تقييم التلألؤ بعد 4 ساعات من العلاج ، أنتج كل من PP242 و rapamycin تثبيطا يعتمد على الجرعة للإشارة. لم ينتج عن PP242 ولا الرابامايسين انخفاضا كبيرا في قابلية الخلية للحياة ، مما يشير إلى أن الانخفاض في اللمعان في نظام تكميل eIF4E-eIF4G لا يرجع إلى موت الخلايا غير المحدد ، بل بسبب اضطراب تفاعل EIF4E-4G. أظهر تحليل اللطخة الغربية ، بعد تجربة سحب m7GTP ، أن الاضطراب بوساطة 4EBP1 لتفاعل eIF4E-eIF4G الداخلي يرتبط بإشارة مقايسة eIF4E-eIF4G المقاسة.

كان PP242 مثبطا أقوى لفسفرة 4EBP1 الإجمالية من الراباميسين. أظهر كلا المثبطين تأثيرا على إشارات mTOR بشكل طبيعي ، حيث يكون الرابامايسين أكثر نشاطا ضد ركائز mTORC1 ، و PP242 يستهدف كلا من mTORC1 و mTORC2. يتمثل الجانب الأكثر أهمية في هذا المنتج في بذر الخلايا في يوم المعاملة ، وإعادة زرع الخلايا في وسط بدون أحمر الفينول ، وتقييم تلألؤ مقايسة تكميل eIF4E-eIF4G ، وتشغيلها في مقايسة الجدوى على نفس اللوحة.

يمكن إجراء مقايسة الجدوى الثانوية لتقييم أي دواء ذو تأثيرات محددة مستهدفة ومحددة.