تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية
يونيو 9, 2020
نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.
يسمح التشريح المجهري بالليزر بالتحليل النسخي للمناطق المحددة مكانيا داخل عينات أنسجة الكلى. يتيح لنا هذا فرصة فريدة لتحديد الهياكل ذات الأهمية حتى بعد حدوث التغييرات الناجمة عن المرض. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه المنهجية في تكاملها مع تقنيات omics الأخرى ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
إنه يوفر اقتصادا ملحوظا في الأنسجة ويسمح بالكشف عن النصوص المعبر عنها بشكل متواضع. بعد الحصول على عينة الأنسجة ، استخدم ناظم البرد على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لقطع العينة بسمك 12 ميكرومتر واستخدم محول الشريحة لتثبيت العينة على شريحة تشريح دقيق ليزر متخصصة. في غضون 10 أيام من التقطيع بالتبريد ، امزج 89.2 ميكرولتر من 10٪ BSA الخالي من RNase في PBS مع أربعة ميكرولترات من الفالودين FITC ، و 1.5 ميكرولتر من DAPI ، وميكرولترين من الجسم المضاد محل الاهتمام المقترن مباشرة ب Alexa Fluor 546 ، و 3.3 ميكرولتر من مثبط RNase.
اغسل الشريحة في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر 100٪ أسيتون لمدة دقيقة واحدة وضع الشريحة في غرفة الرطوبة. اغسل الجزء العلوي من الشريحة مرتين باستخدام PBS جديد خال من RNase لمدة 30 ثانية لكل غسلة ، متبوعا بغسلتين لمدة 30 ثانية مع 10٪ BSA في PBS الخالي من RNase. بعد الغسيل الأخير ، عالج العينة بمحلول الأجسام المضادة المحضر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل غسلها مرتين أخريين باستخدام 10٪ BSA في PBS الخالي من RNase.
بعد الغسيل الثاني ، جفف الشريحة بالهواء لمدة خمس دقائق في غطاء مزرعة الأنسجة قبل تحميل الشريحة على منصة قطع التشريح الدقيق بالليزر. قم بتركيب أنابيب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 500 ميكرولتر ، ومناسبة لأعمال PCR ، وتحتوي على 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للاستخراج من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي على الجهاز. بعد التحميل ، حدد مناطق الاهتمام داخل العينة عن طريق التلوين والتشكل والموقع.
استخدم التألق المناعي لتحديد ما لا يقل عن 500،000 ميكرومتر مربع من الأجزاء ذات الأهمية. ثم ابدأ التشريح الدقيق بالليزر لاستئصال المنطقة باستخدام قوة ليزر أكبر من 40. عند الانتهاء من عملية التشريح الدقيق بالليزر ، قم بتغطية أنابيب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ونفض الغبار عن الأنابيب بقوة لضمان انتقال المحتويات من الأغطية إلى قيعان الأنابيب.
بعد الطرد المركزي ، احتضان الأنابيب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى. ثم انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 500 ميكرولتر من تخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. يتم تحديد الأجزاء الفرعية الأنبوبية في الكلى من خلال تلطيخ الأجسام المضادة للعلامات الأنبوبية الفريدة بالإضافة إلى مورفولوجيا الخلايا والمعالم الهيكلية.
يسهلوضع العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع ميزات الأنسجة المورفولوجية وتحديد المواقع المكانية لهياكل الصورة تصور الأجزاء الفرعية الكلوية بدرجة عالية من الثقة. في تحليل التسلسل التمثيلي هذا ، كان معدل نجاح تلبية الحد الأدنى من مدخلات منطقة التشريح أكبر من 90٪ مما أدى إلى ارتفاع كمية mRNA الإجمالية المتاحة للكشف عن الجينات. في هذا التحليل ، استوفت 100٪ من العينات الحد الأدنى من عتبة الكشف التي لا تقل عن 10،000 جين.
بعد التشريح المجهري بالليزر ، يمكن مقارنة تحليل التخصيب للتعبير الجيني للعلامات المعروفة بتلك الموجودة في المقصورات الأخرى. في هذا التحليل ، تم تحديد علامة واحدة لكل جزء فرعي من خلال النسخ الإقليمية للتشريح المجهري بالليزر والتي أسفرت أيضا عن تلطيخ كيميائي مناعي محدد للجزء الفرعي المقابل. من المهم ملاحظة أن التشريح الدقيق بالليزر يعتمد بشكل كبير على خبرة المستخدم لتحديد الهياكل ذات الأهمية المراد تشريحها بدقة.
تسمح هذه التقنية بدراسة توقيعات التعبير الجيني الإقليمية المحددة التي يمكن استخدامها لتقييم المسارات المحتملة المشاركة في تطور المرض ، بالإضافة إلى بيولوجيا الأنسجة السليمة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً للتشريح الدقيق بالليزر لأجزاء فرعية محددة داخل أنسجة الكلية البشرية، بما في ذلك الكبيبة والأنيبيبات القريبة. يتيح الحمض النووي الريبوزي RNA المعزول من هذه المقصورات إجراء تحليل ترانسكريبتومي للكشف عن التغيرات في أنماط التعبير الجيني المرتبطة بهياكل الكلية المختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- التحليل الترانسكريبتومي
- بيولوجيا الكلى
- استقصاء تطور المرض
خلفية علمية
- أهمية دراسة القطاعات الفرعية للكلى
- التحديات التي تواجه تحليل البنى المحددة مكانياً بعد الإصابة بالمرض
- التكامل مع تقنيات الأوميكس الأخرى
الطرق المستخدمة
- التشريح الدقيق بالليزر (Laser microdissection)
- عينات من أنسجة الكلى البشرية
- عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) وتسلسله
النتائج الرئيسية
- معدل نجاح عالٍ في التشريح واستخلاص RNA
- تحديد واسمات التعبير الجيني للأجزاء الفرعية للكلية
- توضيح المسارات المحتملة المرتبطة بتطور المرض
الاستنتاجات
- يوضح هذا البروتوكول طريقة فعالة لدراسة التعبير الجيني الإقليمي في الكلية.
- تساهم النتائج في فهم بيولوجيا الكلى والآليات المحتملة للأمراض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح التشريح الدقيق بالليزر إجراء تحليل نسخي محدد مكانيًا لأنسجة الكلى البشرية، مما يعالج فجوة حرجة في بيولوجيا الاكتشاف حيث تفتقر الطرق المعتمدة على التفكيك إلى السياق التشريحي. ويدعم هذا النهج التحقق من الأهداف من خلال ربط بصمات التعبير الجيني بأجزاء فرعية محددة من النفرون، مما يعزز الحد من المخاطر الميكانيكية في نماذج أمراض الكلى. توفر هذه الطريقة ثقة تنبؤية لاستقصاء المسارات وتحديد أولويات مجموعة المشاريع في سير عمل الاكتشاف المبكر.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط التعبير الجيني بأقسام الكلى المحددة تشريحيًا.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال توقيعات ترانسكريبتومية مثبتة مكانيًا تحافظ على سياق النسيج.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في الأهداف من خلال ربط التعبير عن العلامات الإقليمية بهوية القطاعات الفرعية الوظيفية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يجهز أنظمة بيولوجية موثقة لسير عمل الأوميكس اللاحقة عن طريق عزل RNA عالي السلامة من مناطق تم تشريحها مجهرياً.
- القيمة التشغيلية: يضمن توحيد المقاييس وقابلية التكرار من خلال معايير مراقبة الجودة التي تقيم مدى كفاية العينة ومعدلات نجاح التشريح.
- القابلية للتوسع: يتيح تقييماً موثوقاً للمركبات من خلال توفير مخرجات ترانسكريبتومية كمية ومحددة مكانياً لحملات الفرز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تربط نتائج الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال نمذجة الأنظمة ذات الصلة بالمرض باستخدام القطع الفرعية للكلى البشرية.
- تطابق المؤشرات الحيوية: تدعم تطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية عن طريق تحديد ملفات تعبير جيني خاصة بمقصورات معينة يمكن اكتشافها في الأنسجة.
- التقدم المعدل وفقاً للمخاطر: ترفد عملية اتخاذ القرارات قبل السريرية من خلال الكشف عن نشاط المسارات في المناطق المتأثرة بالمرض بدقة تشريحية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يأتي التشريح الدقيق بالليزر ضمن سلسلة الاكتشاف التي تمتد من اختبار الفرضيات إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يتيح إجراء تحليل جزيئي بدقة مكانية يربط بين التصوير والعلوم الأوميكية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال ربط التعبير الجيني بالعلامات التركيبية في أنسجة الكلى.
- الفحص: تضمن جاهزية المقايسة من خلال معدل نجاح عالٍ في التشريح (>90%) وإنتاج كمية كافية من RNA لتطبيقات التسلسل.
- التحليلات: توفر قياسات كمية للمتغيرات التابعة (عتبات الكشف عن الجينات ≥10,000 جين) مما يتيح المقارنة بين الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تعزز الاستمرارية قبل السريرية من خلال الحفاظ على السياق المكاني الذي يُفقد في طرق الفصل القائمة على التفكيك.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تعمل كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام عبر أنواع الأنسجة المختلفة عن طريق استبدال الواسمات للأجسام المضادة، مما يدعم تبنيها على مستوى المنصة بالكامل.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الأهداف الكلوية.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال معاملات سير عمل محددة ونقاط تفتيش لمراقبة الجودة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين تحديد الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر بناءً على البيولوجيا الخاصة بالقطاعات الفرعية.
- التأثير على المحفظة: تدعم كفاءة رأس المال من خلال الحد المبكر من مخاطر الأهداف الكلوية باستخدام أدلة ذات دقة مكانية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في صبغ التألق المناعي والتعرف المورفولوجي على القطاعات الفرعية الكلوية.
- يعتمد على منصات التشريح الدقيق بالليزر وأطقم عزل RNA المتوافقة مع العينات ذات المدخلات المنخفضة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق بالنسبة لبروتوكولات الصبغ، وعتبات التشريح، ومقاييس مراقبة الجودة.
- يتطلب التكيف عبر النماذج المختلفة التحقق من صحة واسمات الأجسام المضادة والمعالم الهيكلية في الأنسجة المستهدفة.
- تشمل القيود العملية دقة تحديد المنطقة التي تعتمد على المستخدم والحفاظ على سلامة RNA أثناء المعالجة.
