نهج قائم على قياس الطيف الكتلي لتحديد فوسفاتيز فوسفوبروتين وتفاعلاتها

PIB-MS هي تقنية جديدة تستخدم لإثراء فوسفاتيز البروتين الفوسفوري الداخلي المنشأ وهي تتفاعل مع البروتينات من الخلايا والأنسجة. وهو ينطوي على تحديد هذه البروتينات وتحديدها كميا باستخدام البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي. لا تتطلب هذه التقنية التعبير الخارجي عن الإصدارات الموسومة من فوسفاتيز البروتين الفوسفوري التي يمكن أن تغير نشاط البروتين أو توطينه.

أيضا ، لا يستخدم الأجسام المضادة التي قد تكون غير محددة أو غير قادرة على التمييز بين أشكال متساوية محددة. يمكن تحجيم هذه الطريقة للتحقيق في PPPM لاستخدامها في كل شيء من الخلايا إلى العينات السريرية. للبدء ، اجمع حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 277 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

إزالة الوسائط وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من PBS. قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل كما هو موضح في بروتوكول النص واحتفظ به على الجليد. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتحلل المبرد إلى العينات ، ثم قم بتجانس العينات عن طريق الرنين واحتفظ بالخلايا على الجليد بين البقوليات.

انقل الليزات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر جديدة. الطرد المركزي للعينة الصوتية عند 21 ، 130 مرة غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استخدم أليكوت من الليزات لقياس تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك.

هذه الخطوة ضرورية لضمان تركيز متساو للبروتين في كل عينة. للتحكم في مثبطات فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتيني ، قم بإعداد اثنين من الأليكوت بتركيز متساو للبروتين لكل عينة. يمكن استخدام المخزن المؤقت للتحلل لتخفيف العينات بحيث يكون لكل أنبوب تركيز متساو من البروتين.

أضف ميكرومولار واحد من microcystin-LR المجاني إلى أليكوت واحد وحجم متساو من DMSO إلى الآخر. دوامة العينات واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة. يجب أن يتم تحضير حبات مثبطات الفوسفاتيز في وقت مبكر أو أثناء خطوات الحضانة الموضحة في قسم إعداد العينة.

استخدم 10 ميكرولترات من حبات مثبطات الفوسفاتيز الصلبة ، أو راتنج PIB ، للحصول على ملليغرام واحد من البروتين وأضفها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. اغسل PIBs ثلاث مرات باستخدام 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل عن طريق الدوامة تليها الطرد المركزي عند 376 مرة جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتحلل إلى PIBs المغسولة لإنشاء محلول مخزن مؤقت PIB بنسبة 50٪ حسب الحجم.

اخلطي عن طريق سحب طرف الماصة والطين بلطف وقم بتدوير طرف الماصة والملاط لإعادة تعليق PIBs. انقل 20 ميكرولتر من الملاط إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحليل. قم بتدوير الأنابيب بسرعة 376 مرة جم لمدة 30 ثانية.

يحتوي كل أنبوب على كميات متساوية من PIBs فيه. تخلص من السوبرناتانت مع ترك الراتنج الصلب فقط وما يصل إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل في كل أنبوب. انقل الليزات إلى الأنابيب ذات العلامات المناسبة التي تحتوي على PIBs.

احتضن الليزات مع PIBs لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 8 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة مع lysate ، قم بالطرد المركزي ل PIBs عند 376 مرة g لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل الخرز بإضافة 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل وعكس الأنابيب جمع الخرز عن طريق الطرد المركزي وإزالة السوبرناتانت.

كرر هذه الخطوة لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة مخزن التحلل المؤقت قدر الإمكان دون سحب PIBs. قم بإعداد مخزن مؤقت للإزالة يحتوي على 2٪ SDS وأضف المخزن المؤقت للإزالة أربعة إلى خمسة أضعاف حجم PIBs.

احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتلويح فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتين من الخرز. قم بطرد الأنابيب مركزيا بسرعة 376 مرة جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. اجمع اللوات في أنبوب منفصل وتابع تحليلات قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي.

لتجديد PIBs ، احتضنها في محلول SDS بنسبة 2٪ مع الدوران عند 8 دورات في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخرز ثلاث إلى خمس مرات في 25 ملليمولار Tris-HCl pH 7.5 مع الدوران لمدة 30 دقيقة لكل غسلة. تخزين PIBs في 25 ملليمولار تريس HCL الرقم الهيدروجيني 7.5 مع أزيد الصوديوم.

بالنسبة لتحليل الطيف الكتلي ، تختلف طرق تصفية البيانات وتحليلها ويمكن أن يقوم بها الباحث أو منشأة أساسية. بعد البحث في البيانات الخام مقابل قاعدة بيانات بروتيوم خاصة بالأنواع، قم بتصفية نتائج البحث وتصديرها كورقة عمل Microsoft Excel. تحليل البيانات في ثلاثة أضعاف.

للقياس الكمي الخالي من التسميات، استخدم قياسات منطقة الذروة MS1 لتحديد كمية البيانات. لتحديد الوحدات الفرعية PPP ومتفاعلاتها من جديد ، قارن بين الثلاثية البيولوجية للعينات المثبطة للميكروسيستين - LR والعينات المعالجة ب DMSO. قم بتصفية البيانات بحيث لا يوجد سوى البروتينات التي يزيد إجمالي عدد الببتيد فيها عن واحد في عينتين على الأقل من العينات الثلاث المعالجة بالتحكم في DMSO.

لتصفية البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بالراتنج ، قم بإزالة البروتينات التي يكون فيها إجمالي عدد الببتيد في الحالة المعالجة بالميكروسيستين LR أعلى من أي وحدة فرعية حفازة PPP. استبعاد الملوثات الشائعة مثل الكيراتين والكولاجين والبروتينات الريبوسومية والبروتينات النووية النووية غير المتجانسة من التحليل. يعد ملف CSV ضروريا لاستيراد البيانات إلى Perseus.

استيراد البيانات التي تمت تصفيتها إلى Perseus بالنقر فوق تحميل مصفوفة عامة في قسم تحميل. قم بتحويل البيانات بالانتقال إلى التحويل الأساسي وتحديد البيانات وتحديد دالة التحويل كقاعدة سجل 2 من x. قم بإسناد القيم المفقودة من توزيع عادي بالانتقال إلى الإسناد، واستبدل القيم المفقودة من التوزيع العادي، وحدد البيانات وحدد العرض وإزاحة الأسفل للحساب.

قم بإجراء التطبيع الكمي من خلال الانتقال إلى التطبيع الكمي. أضف تعليقات توضيحية على البيانات بالانتقال إلى صفوف Annot، صفوف التعليقات التوضيحية الفئوية. قم بإجراء اختبار T للطالب من خلال الانتقال إلى الاختبارات ، والاختبارات المكونة من عينتين ، وتحديد المجموعات ، والاختبار المطلوب إجراؤه ، وطريقة تصحيح اختبار الفرضيات المتعددة كما هو مستخدم في الاقتطاع.

تقوم هذه الدالة أيضا بحساب نسب السجل 2. تم تحديد فوسفوتات البروتين الفوسفوبروتين والجهات الفاعلة البينية الخاصة بها في خلايا HeLa باستخدام تجربة سحب PIB ، تليها تحديد كمي خال من الملصقات لوفرة البروتين في العينات المعالجة ب DMSO و microcystin-LR. حددت مخطط بركان لتحليل الطيف الكتلي روابط PIB محددة تظهر باللون الأحمر ، ووحدات فرعية حفازة باللون الأزرق ، ووحدات فرعية مرشحة جديدة ل PPP ، أو البروتينات المتفاعلة ، باللون الأبيض.

تم عرض المجلدات غير المحددة باللون الرمادي. وأظهرت القطعة المبعثرة لمنطقة log2 من محللة خلايا HeLa المعالجة ب DMSO أن الوفرة كانت مترابطة إلى حد كبير، مما يشير إلى إمكانية تكرار البيانات. أظهر تحليل الشبكة لجميع الوحدات الفرعية فوسفاتيز البروتين الفوسفوري والبروتينات المتفاعلة أن هذه البروتينات كانت مفاعلات متفاعلة محددة في سحب PIB.

ويمكن إجراء تحليلات عالمية للبروتينات ومقارنة النتائج بتحليل PIB لتحديد ما إذا كان تكوين PPPome مدفوعا بوفرة تعادل القوة الشرائية أو تنظمه آليات ما بعد الترجمة. PIB-MS هي أداة قابلة للتطبيق على نطاق واسع سمحت لنا بتحديد الاختلافات في أنماط التعبير PPP في ظل ظروف مختلفة مثل العينات البينية مقابل العينات الانقسامية أو الاختلافات بين خطوط الخلايا السرطانية.