A - 2 لأسلوب التصوير فوتون من تدفق الدم في القشرة المخية الحديثة من خلال نافذة القحف

تعد القدرة على تصوير الأوعية الدموية الدماغية وتسجيل ديناميكيات تدفق الدم في الدماغ السليم للقوارض الحية تقنية قوية يمكن تطبيقها في دراسة نقص تروية الدماغ أو فسيولوجيا الدماغ الطبيعية. سنقوم هنا بتوضيح كيفية استخدام المجهر الضوئي الثنائي لتصوير ديناميكيات تدفق الدم في القشرة الحديثة للفئران الحية باستخدام صبغات فلورية تُحقن في وريد الذيل. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل بواسطة David Kleinfeld وWinfred Dank.

أهلاً بكم، أنا ريكاردو موتا من مختبر كارلوس بورتر كايو في قسم أمراض الأعصاب بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس. في فيديو سابق، عرضنا لكم طريقة زرع نافذة قحفية لتجارب التصوير المزمن في الجسم الحي. واليوم، سنعرض لكم إجراء تصوير ديناميكيات تدفق الدم في القشرة الدماغية من خلال نافذة قحفية.

يعد هذا التحضير مفيداً للغاية لأنه يتيح تصوير مناطق عميقة داخل الدماغ باستخدام مجهر الليزر ثنائي الفوتون. لذا، لنبدأ العملية. ومن أجل تصوير الأوعية الدموية الدماغية، يجب حقن الحيوانات وريدياً بصبغة فلورية.

نستخدم صبغات الديكستران المقترنة لأن شق الديكستران يمنع الصبغة من عبور الحاجز الدموي الدماغي والتسرب من الأوعية الدموية. يتم تخدير الفئران باستخدام isof fluorine، بنسبة 4% للتحريض ومن 1.5 إلى 2% أثناء الحقن. بعد ذلك، يتم تعقيم الذيل بثلاث مسحات من كحول 70%، ثم يتم حقن 75 إلى 100 µL من محلول بتركيز 5% من R domine Dextran المذاب في محلول ملحي عبر وريد الذيل باستخدام إبرة قياس 26 gauge.

يمكن تصوير الحيوانات في منتصف محور الذيل فوراً بعد الحقن في وريد الذيل وحتى يتم إفراز الصبغة في البول، والذي سيتحول إلى اللون الوردي في حال استخدام صبغة ERO domine. وفي غضون ساعتين تقريباً بعد حقن صبغة Dexter الفلورية، يتم تخدير الفأر باستخدام isof fluorine؛ بنسبة 4% للتحريض، ومن 1 إلى 1.5% للتصوير. يتم تثبيت الفأر بإحكام باستخدام قضيب تيتانيوم على منصة المجهر، والتي تحتوي على وسادة تسخين منظمة حرارياً للحفاظ على دفء الحيوان.

يتم وضع بعض مرهم العين للحفاظ على رطوبتها. تُنظف الشريحة الغطائية للنافذة القحفية بكحول بتركيز 70%. يتم وضع النافذة موازية للمستوى البؤري وفي مركز مجال الرؤية.

باستخدام الشيئية ذات التكبير 4x، يفضل التقاط صورة للأوعية الدموية على سطح الدماغ بواسطة كاميرا رقمية. ستُستخدم هذه الصورة كمرجع في جلسات التصوير التالية لتحديد منطقة التصوير بشكل متكرر من يوم لآخر. ثم تُستبدل الشيئية 4x بشيئية غمر مائي بتكبير 40x.

يتم التقاط الصورة الرقمية للمشهد دون تحريك المنصة. ثم تُضبط إحداثيات مُحرك المنصة على الصفر مرة أخرى. ونستخدم برنامج scan image كبرمجية لالتقاط الصور.

تم كتابة هذا البرنامج باستخدام MATLAB بواسطة توم بول رودو وبرناردو ساباتيني في مختبر كارلز فوتو. نقوم بعد ذلك بتشغيل جميع المعدات الأخرى، مثل الليزر، ومقياس القدرة، وأنابيب المضاعف الضوئي، والمضخمات، وما إلى ذلك. يتم مسح منطقة النافذة المناسبة للتصوير سريعاً بتكبير منخفض للعثور على أفضل المناطق.

بمجرد تحديد هذه المناطق، يتم التقاط مجموعة صور بتكبير منخفض للمنطقة المختارة للتصوير، مع تدوين إحداثيات XY الخاصة بها لتسجيل ديناميكيات تدفق الدم في الأوعية الصغيرة أو الشعيرات الدموية. نحن نستخدم عمليات مسح خطية على طول 40 ميكرون على الأقل من الوعاء الدموي المستهدف. وتُجرى عمليات المسح الفردية هذه، والتي تستغرق ثانية واحدة، باستخدام أقل قدر ممكن من طاقة الليزر، كما يتم تدوين الإحداثيات وزاوية المسح.

بمجرد انتهاء جلسة التصوير، يُنقل الحيوان إلى غرفة دافئة حيث يمكنه التعافي من التخدير. نعرض هنا هنا مجموعة من مائة صورة تم التقاطها كل خمس ميكرونات باستخدام مجهر الفوتونين الخاص بنا من خلال نافذة قحفية وضعت فوق القشرة الحسية الجسدية لفأر يبلغ من العمر خمسة أشهر تم حقنه بـ r Domine dextran عبر وريد الذيل. ويظهر هذا التسلسل من الصور الشبكة المعقدة للأوعية الدموية الكبيرة والصغيرة، بما في ذلك الشعيرات الدموية.

لقد عرضنا لكم للتو طريقة لتصوير ديناميكيات تدفق الدم داخل الجسم الحي عبر نافذة قحفية. وتعد هذه الطريقة فعالة للغاية لتصوير ديناميكيات تدفق الدم الدماغي في الأوعية الدموية القشرية، على سبيل المثال، لبحث التغيرات في تدفق الدم بعد السكتة الدماغية. ويمكن إجراء عمليات تصوير متعددة في أوقات مختلفة من خلال استخدام حقن متكررة للصبغة الفلورية في الوريد الذيلي.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل في أنظف الظروف وأكثرها تعقيماً قدر الإمكان، والحفاظ على ثبات يدك بدقة. حسناً، هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجربتك.