فهم التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا من خلال الصور المجهرية الديناميكية وثلاثية الأبعاد

الهدف من بحثنا هو مراقبة التغيرات في شبكات الميتوكوندريا والتحقيق في كيفية تغير شبكات الميتوكوندريا هذه استجابة للظروف الخلوية. نحن نستخدم أدوات مفتوحة المصدر مثل فيجي وبايثون ، ونجمع بين المكتبات الحالية ووحدات الماكرو والبرامج النصية المخصصة لأتمتة تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا من بيانات الفحص المجهري الفلوري المعقدة. لا يزال تحقيق بيانات ومقاييس كمية موثوقة تصف ديناميكيات انشطار الميتوكوندريا والاندماج مع توطينها في 3D يمثل تحديا.

التوحيد القياسي لتوليد البيانات هذا غير متاح بشكل شائع. لذلك ، توجد معرفة محدودة حول تردد الانشطار والاندماج الخاص بالخلية والتوطين داخل الخلايا. أضفنا الكشف عن حياة انشطار الميتوكوندريا والاندماج إلى مقاييس البحث المتاحة.

ومن خلال الجمع بين هذه وعدد بنية الميتوكوندريا ، تمكنا من تحديد مقياس جديد لفهم ديناميكيات شبكة الميتوكوندريا. تسمح لنا النتائج التي توصلنا إليها بتوصيف معلمات الانشطار والاندماج الخاصة بالخلية ولأول مرة تحديد ما إذا كان نظام الميتوكوندريا في حالة توازن أو تحول. وهذا يمنع سوء التفسير الكبير للأنماط الظاهرية في الصحة والمرض ويوفر إطارا واضحا للإبلاغ الدقيق.

للبدء ، افتح الملف الخام في ImageJ. اضبط إعدادات اللون لتحسين رؤية منطقة الاهتمام ولكن لا تقم بتعيين أي شيء. قم بتكرار الصورة وفقا لعدد الخلايا المفردة التي تحتاج إلى تحليلها.

إذا كانت هناك خلايا متعددة في مجال الرؤية، فانتقل إلى تحليل، وأدوات، واستخدم أداة Windows المتزامنة وأداة الرسم اليدوي لرسم منطقة اهتمام حول خلية ذات اهتمام، ثم حدد تحرير واختر مسح خارج لعزل الخلية المحددة. قم بتقسيم القنوات الحمراء والزرقاء عن بعضها البعض واحفظ قناة الميتوكوندريا كملف tif. لإنشاء دالة انتشار نقطي أو PSF، أعد فتح الصورة الأولية.

ثم افتح المكون الإضافي لمولد PSF عن طريق تحديد المكونات الإضافية ، ثم اختيار PSF Generator وتحديد النموذج البصري Born wolf 3D. افتح معلومات الصورة للصورة الأولية عن طريق تحديد صورة، ثم اختيار إظهار المعلومات أو بالضغط على I على لوحة المفاتيح. قم بالتمرير إلى أسفل نافذة معلومات الصورة.

حدد خيار حجم وعمق الفوكسل وقم بتغيير الطول الموجي إلى 568 نانومتر. اضبط حجم البكسل XY على 166.1 نانومتر ، والخطوة Z على 200 نانومتر. اضبط حجم XYZ لمطابقة دقة صورة تبلغ 512 × 512، وقم بتكوين مكدس Z ليحتوي على 10 شرائح Z.

انقر فوق تشغيل. احفظ PSF كملف tif في مجلد خاص به. انتقل إلى المكونات الإضافية ، وحدد وحدات الماكرو ، ثم اختر تحرير ، متبوعا Deconvolution_time_lapse_mine.

IJM للوصول إلى ماكرو deconvolution. قم بتحرير خطوط الإدخال والإخراج كما هو مطلوب واضغط على تشغيل لتنفيذ الماكرو. لتحسين تباين الصورة وتعتيمها، انتقل إلى المكونات الإضافية، وحدد وحدات الماكرو، واختر تحرير وافتح المعالجة المسبقة.

IJM للوصول إلى ماكرو المعالجة المسبقة. قم بإجراء طرح الخلفية عن طريق ضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على 6. اضبط مرشح سيجما بلس بحيث يتم ضبط نصف القطر على 1 ضعف عامل المقياس.

عدد وحدات البكسل المستخدمة هو 2 ، والحد الأدنى لكسر البكسل هو 0.2 ، مما يضمن ضبط المكون الإضافي ليكون أكثر وعيا بالبكسل. اضبط إعدادات CLAHE عن طريق تكوين حجم الكتلة إلى 64 ، وصناديق الرسم البياني إلى 256 ، والحد الأقصى للميل إلى 2.5 ، وجاما إلى 0.8 ، ثم انقر فوق تشغيل. افتح ملفا ذا أهمية تم تعديله باستخدام العملية المسبقة.

وحدات ماكرو ijm في ImageJ. انتقل إلى المكونات الإضافية وحدد عتبة التكيف. اضبط الحد المحلي على المتوسط المرجح واضبط حجم كتلة البكسل حسب الحاجة.

انقر فوق معاينة واضبط حجم الكتلة لتضمين أكبر عدد ممكن من الميتوكوندريا بوضوح. قم بتعديل قيمة الطرح لكل خلية لإزالة الخلفية غير الضرورية ، ولاحظ الصورة المجهرية الناتجة. لتحسين الوقت ، قم بفرز الصور في ملفات وفقا لقيمة الطرح المطبقة.

انتقل الآن إلى المكونات الإضافية ، وحدد وحدات الماكرو ، واختر تحرير وافتح Threshold. IJM للوصول إلى ماكرو العتبة. قم بتحرير البرنامج النصي للماكرو لتحديد مسارات الإدخال والإخراج الصحيحة وحجم الكتلة وطرح القيم.

انقر فوق تشغيل لتنفيذ الماكرو. افتح ما يصل إلى 10 صور مجهرية عتبة تنتمي إلى نفس حالة العلاج. انتقل إلى الصورة والمكدسات والأدوات وحدد Concatenate ، ثم اضغط على إزالة النقاط الصغيرة المتبقية OK.To وراءها عن طريق العتبة ، وانتقل إلى المكونات الإضافية ، متبوعا بعوامل تصفية الصور المتكاملة ، ثم حدد إزالة القيم المتطرفة.

استخدم المعاينة لضبط الأحجام X وY لإزالة الأجزاء. احفظ الملف المتسلسل كملف TIF. أخيرا ، انتقل إلى المكونات الإضافية ، وحدات الماكرو ، تحرير ، QuickTest_new.ijm.

قم بتحرير خطوط مسار الإدخال والإخراج للإشارة إلى الدلائل المناسبة، وانقر فوق تشغيل وتصور مترجم أحداث الميتوكوندريا أو نتائج MEL. تم تتبع ديناميكيات الميتوكوندريا بمرور الوقت مع علامات النقاط الحمراء على أحداث الانشطار والنقاط الخضراء التي تشير إلى أحداث الاندماج في كل من طرق العرض ثلاثية الأبعاد و ثنائية الأبعاد. أظهرت شبكات الميتوكوندريا اختلافات خاصة بالعلاج في الهيكل بمرور الوقت مع أشكال أكثر استطالة وترابطا في الخلايا المعالجة بالميتفورمين والشبكات المجزأة للغاية في الخلايا المعالجة بالميتفورمين CCCP Baf.

أظهرت مجموعة الميتفورمين CCCP Baf نشاط انشطار وانصهار أعلى بشكل ملحوظ من مجموعات التحكم أو الميتفورمين فقط ، مما يشير إلى زيادة إعادة تشكيل الميتوكوندريا. كان لهذه المجموعة أيضا عدد ميتوكوندريا أعلى بكثير ، بما يتفق مع التجزئة المحسنة. تم تقليل حجم الميتوكوندريا بشكل كبير في نفس المجموعة ، مما دعم التحول نحو الانشطار.

ومع ذلك ، عند تطبيعها إلى عدد الميتوكوندريا ، أظهرت مجموعة الميتفورمين فقط أعلى نشاط ديناميكي نسبي ، مما يشير إلى أن الميتفورمين وحده يعزز شبكة إعادة تشكيل أكثر نشاطا وكفاءة ، بينما تؤدي المعالجة المشتركة إلى دوران هيكلي واسع النطاق ولكنه أقل كفاءة.