دليل تدريجي لعزل وتحليل سطح الورقة والحمض النووي الريبي الرسولي باستخدام وريدات نبات الأرابيدوبسيس

نحن نحاول أن نفهم كيف تنظم النباتات ميكروبيوماتها وما إذا كانت الحمض النووي الريبي الذي تفرزه النباتات ينظم التعبير الجيني في كل من الميكروبات بدائية النواة وحقيقية النواة التي تستعمر النباتات. نحن نستخدم مزيجا من الرحلان الكهربائي عالي الدقة للغلاف والتحليل القائم على Illumina لتقييم الحمض النووي الريبي الموجود على سطح الورقة وكيف تتغير استجابة للإجهاد الحيوي. بينما تشير الدراسات الحديثة إلى أن الحمض النووي الريبي خارج الخلية يتم تناوله بواسطة مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية ، فإن الآليات الأساسية لامتصاص الحمض النووي الريبي والعواقب الوظيفية لهذا الامتصاص لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير.

للبدء ، خذ نباتات نبات الأرابيدوبسيس التي يبلغ عمرها ستة إلى سبعة أسابيع لكل تكرار. أضف الصورة الظلية L-77 إلى VIB المعقم ، قبل البدء في عزل غسل سطح الأوراق. ثم باستخدام أسطوانة قياس ، انقل 100 مل من محلول VIB المحضر إلى زجاجة رذاذ سعة 500 مل.

باستخدام مقص ناعم ، افصل وريدات نبات الأرابيدوبسيس بعناية عن جذورها. بعد ذلك ، استخدم فرشاة ناعمة لإزالة أي تربة زائدة من البتلات. ضع الوريدات المنفصلة على صينية مسطحة بحيث يكون السطح المحوري متجها لأعلى.

ثم رش السطح المحوري باستخدام خمس مضخات من زجاجة الرش مملوءة ب VIB وعامل ترطيب. اقلب الوريدات بحذر ورش السطح المحوري. قم بإعداد المحاقن المعدلة ذات الفتحات في الأسفل عن طريق لفها بغشاء بارا حول الرقبة لتعليق الطرف فوق قاع الزجاجة.

لاستعادة غسل سطح الورقة ، أدخل الوريدات المرشوشة برفق في المحاقن المعدلة بدون إبر سعة 60 ملليلتر الموضوعة داخل زجاجات الطرد المركزي سعة 250 مل ، ورش مضختين ثابتتين من المخزن المؤقت في المحقنة. ثم قم بالطرد المركزي للزجاجات المحملة على حرارة 100 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. الآن قم بتصفية سطح الورقة المستعاد من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر واجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، ويتم الاحتفاظ به على الثلج.

بالنسبة لطريقة مسحة سطح الورقة ، قم برش الوريدات المنفصلة بمحلول VIB وعامل الترطيب بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة السابقة. لاستعادة مسحة سطح الورقة ، استخدم أعواد طرف القطن المعقمة لمسح كل من الأسطح المحوري والأبمحورية للوريدات. ثم اضغط على الأطراف المنقوعة على الجدار الداخلي لأنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لاستخراج السائل.

قم بتصفية عينة مسحة سطح الورقة المستخرجة ، من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في أنبوب اثنين من الملليلتر يوضع على الثلج. ضع نفس مجموعة النباتات المستخدمة سابقا لغسل سطح الأوراق أو عزل المسحة في دورق نظيف واشطفها برفق مرتين بالماء المقطر. لتسلل الوريدات بالمكنسة الكهربائية باستخدام VIB ، ضع الوريدات المغسولة بعناية في آلة صنع القهوة الفرنسية التي تحتوي على 300 إلى 500 مل من VIB.

قم بتأمين الغطاء وخفض المكبس برفق حتى تغمر الوريدات بالكامل. أدخل المكبس الفرنسي في غرفة مفرغة وضعي مكنسة كهربائية لمدة 20 ثانية باستخدام مضخة تفريغ حتى يتم تسلل النباتات جيدا. بعد تحرير المكنسة الكهربائية ، أخرج المكبس الفرنسي من الغرفة وانزع الغطاء.

صب VIB في دورق بلاستيكي سعة 500 مل وقم بإزالة الوريدات. ثم هز الوريدات برفق وادهن الأوراق عبر منشفة ورقية لإزالة المخزن المؤقت الزائد. الآن باستخدام ورق النشاف ، امسح أسطح الأوراق برفق لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي.

لتجميع سائل الغسيل اللابلاستيكي ، أدخل الوريدات المتسللة VIB في محاقن عديمة الإبر سعة 60 ملليلتر ، موضوعة داخل زجاجات طرد مركزي سعة 250 مل كما حدث سابقا. قم بالطرد المركزي للزجاجات عند 600 جرام لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع تسارع بطيء. ثم قم بتصفية سائل الغسيل البلاستيكي المجمع من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في أنبوب 15 مل يوضع على الثلج.

قم بإعداد أو شراء جل صغير يحتوي على 10 أو 15٪ بولي أكريلاميد وسبعة أضراس يوريا في محلول حمض تريسبوريك EDTA ، باستخدام محلول الأكريلاميد والمكرر. ثم امزج عينات الحمض النووي الريبي مع مخزن مؤقت لتغيير الطبيعة مرتين. سخني المزيج على حرارة 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وضعيه على الفور على الثلج.

الآن قم بحل عينات الحمض النووي الريبي في 0.5 مرة TBE تعمل بالمخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة عن طريق تطبيق 220 فولت لمدة ساعة و 15 دقيقة تقريبا. ثم قم بتلطيخ الجل بصبغة جل الحمض النووي Cyber Gold في 0.5 مرة TBE لمدة 10 دقائق. اشطف الجل مرتين بالماء المقطر وقم بتصويره باستخدام نظام التصوير.

لتحديد نطاقات الحمض النووي الريبي التي تم حلها ، استخدم طريقة تحليل الهلام من وثائق Image J ضمن قائمة التحليل وتحليل الجل. قم بإعداد معايير الحمض النووي الريبي لنسختين مكررات تقنيتين عن طريق تخفيف الحمض النووي الريبي المحلل للخلية في المياه الخالية من RNase و DNase. لتحضير 1.5 مرة من صبغة هلام الحمض النووي من الذهب الإلكتروني ، قم بإذابتها في 500 ملليمولار من محلول ثلاثي HCL عند درجة الحموضة الثمانية.

لإعداد الصفيحة الدقيقة ، أضف 99 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل بئر. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي إلى كل بئر باستخدام نفس الحجم لكل من عينات الحمض النووي الريبي ومعاييرها. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من محلول الذهب الإلكتروني إلى كل بئر.

لتعيين معلمات قارئ اللوحة الصغيرة، اختر إما الاهتزاز الخطي أو المداري لمدة ثلاث ثوان. اضبط قارئ اللوحة الدقيقة على وضع نقطة نهاية التألق بطول موجة إثارة يبلغ 496 نانومتر وطول موجي انبعاث يبلغ 540 نانومتر. قم بإنشاء خط معايرة باستخدام قيم شدة التألق من معايير الحمض النووي الريبي.

كشف تحليل هلام الحمض النووي الريبي غير الطبيعة أن كلا من عينات غسل سطح الأوراق وسوائل الغسيل غير البلاستيكية تحتوي على مجموعة واسعة من أحجام الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك أنواع الحمض النووي الريبي الطويلة والصغيرة. كانت كميات الحمض النووي الريبي الإجمالية المعزولة من سائل الغسيل اللابلاستيك وغسل سطح الورقة متشابهة ، عند تطبيعها لوزن النبات الجديد. تختلف ملامح الحمض النووي الريبي لغسل سطح الأوراق ، والغسيل غير البلاستيكي ، ومحللة الخلية بشكل ملحوظ ، مما يؤكد الحد الأدنى من تلوث الحمض النووي الريبي داخل الخلايا ويظهر أن الحمض النووي الريبي اللاتنسجي تتم معالجته بشكل كبير مع نطاقات الوزن الجزيئي المنخفضة المنتشرة إضافة 0.001٪ صورة ظلية L-77 إلى المخزن المؤقت لعزل الحويصلة ضاعف تقريبا عائد الحمض النووي الريبي من أسطح الأوراق مقارنة بالمخزن المؤقت بدون عامل الترطيب.

لكن زيادة هذا التركيز إلى 0.01٪ لم تعزز استعادة الحمض النووي الريبي. استعاد الغسيل الثاني لنفس الأوراق ما يقرب من 63٪ من الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه في الغسيل الأول ، مما يشير إلى استمرار إفراز الحمض النووي الريبي على سطح الورقة. أظهر القياس الكمي للحمض النووي الريبي ، باستخدام فحوصات لوحة التيتر الدقيقة القائمة على التألق ، خطية عالية مع تركيز الحمض النووي الريبي لكل من طرق الكشف عن الذهب الإلكتروني و RIBO 488.

لقد أظهرنا أن الأجزاء المشتقة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي ، أو TDRs وفيرة بشكل خاص في الحمض النووي الريبي خارج الخلية ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى مقاومتها للتحلل. لذلك نعتقد أن هذه TDRs من المحتمل أن تنظم التعبير الجيني في البكتيريا. نرغب في تحديد المصادر الخلوية للحمض النووي الريبي لسطح الورقة والأدوار البيولوجية التي قد يلعبها RNase لسطح الورقة في سياق تفاعلات الميكروبات المخطط لها.