قياس التدفق الخلوي وتحليل الخلية المفردة لتوصيف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في نمو دماغ الفئران المبكر بعد الولادة

يستكشف بحثنا كيف تؤثر الخلايا الدبقية الصغيرة على إصلاح الدماغ بعد إصابة دماغية قبل الولادة. ونهدف إلى تحديد ما إذا كان تعديل نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن يحسن النتائج العصبية طويلة المدى. أعتقد أن هذا هو تعقيد استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة وتحديات وصف تلك الاستجابات بالطريقة الأكثر دقة لتمثيل الاستجابات والأمراض الفسيولوجية ، ولكن أيضا المرضية.

نحن نستخدم طرائق مختلفة ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وتجارب قياس التدفق الخلوي ، لتوصيف حالات الخلايا الدبقية الصغيرة ووظيفتها في الدماغ النامي بعد إصابة ما قبل الولادة. يتمثل التحدي الرئيسي في الحفاظ على بقاء الخلايا وهوية الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء العزلة ، خاصة في النقاط الزمنية لحديثي الولادة عندما تكون أعداد الخلايا المخيخية محدودة. إنه يثير تساؤلات حول كيف تؤدي الإهانات المخيخية في وقت مبكر من الحياة إلى تغيير النسخ في المجموعات السكانية الدبقية الصغيرة وكيف يمكن للعلاجات المستهدفة تعديل هذه التغييرات.

للبدء ، قم بتشريح منطقة الدماغ المحددة للفئران حسب الحاجة. باستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري صغير يحتوي على وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الموضوعة على الجليد للحفاظ على بقاء الخلية. باستخدام ماصة ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة من طبق بتري.

ثم ، باستخدام مشرط ، قم بقطع أنسجة المخ جيدا في نفس طبق بتري. انقل أنسجة المخ المتجانسة إلى أنابيب سعة خمسة ملليلتر للهضم الأنزمي. أضف ملليلتر من محلول الملح المتوازن من هانكس المكمل بالكولاجيناز D و DNase 1 لكل أنبوب ، وأغلق الأغطية بإحكام باستخدام Parafilm.

ثم احتضن الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ورجها كل خمس دقائق. لإيقاف الهضم ، ضع الأنابيب على الثلج. بعد ذلك ، قم بتمرير المتجانس من خلال مرشح شبكي معدني مقاس 140 ميكرومتر لإزالة الحطام الكبير.

باستخدام مدقة زجاجية ، قم بفصل الخلايا المتبقية على الفلتر برفق. اغسل الفلتر الشبكي المعدني عدة مرات بثلاثة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة لكل غسلة. الآن ، باستخدام ماصة 10 ملليلتر ، اجمع المرشح وانقله إلى أنبوب 15 مل.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اقلب الأنبوب بعناية للتخلص من الطافية. باستخدام الرف, اكشط الأنبوب برفق لإعادة تعليق الحبيبات.

ثم أضف 10 ملليلتر من محلول وسط غروي قائم على السيليكا بنسبة 37٪ إلى الخلايا المعلقة. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 500 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية بأقل قدر من قوة الكسر. باستخدام ماصة 10 ملليلتر ، استنشق طبقة المايلين من أعلى المحلول.

لغسل الخلايا ، أضف 10 ملليلتر من محلول الملح المتوازن من هانكس ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 جرام لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات ، أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت إلى الأنبوب. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات النهائية في المخزن المؤقت المتبقي للتطبيقات النهائية.

انقل جميع الخلايا المعزولة إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا ذات قاع مخروطي الشكل. قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. اقلب اللوحة بسرعة بحركة واحدة للتخلص من المادة الطافية.

ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية في 25 ميكرولتر من محلول الحظر, واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لتحضير مزيج تلطيخ الأجسام المضادة خارج الخلية ، قم بالطرد المركزي لأنابيب مخزون الأجسام المضادة عند 10 ، 000 جرام لإزالة الركام. دون إزعاج الحبيبات ، استنشق الحجم المطلوب من المادة الطافية.

باستخدام المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت ، اضبط الحجم الإجمالي إلى 25 ميكرولترا. الآن ، أضف 25 ميكرولتر من مزيج تلطيخ الأجسام المضادة خارج الخلية إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدون خلط ، أضف 150 ميكرولتر من مخزن فرز الخلايا المنشط بالفلورسنت إلى كل بئر.

قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اقلب اللوحة بسرعة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت ، وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.

أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصابونين بارافورمالديهايد لإصلاح الخلايا ونفاذتها. ثم احتضن الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء. بدون خلط ، أضف 100 ميكرولتر من الصابونين إلى كل بئر.

قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 جرام لمدة ست دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصابونين. بعد ذلك ، قم بإعداد ضوابط التعويض عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الخرز إلى 11 بئرا فارغة.

لتحضير مزيج تلطيخ الأجسام المضادة داخل الخلايا ، قم بتصنيع أنابيب مخزون الأجسام المضادة للطرد المركزي عند 10 ، 000 جم لإزالة المجاميع المحتملة. دون إزعاج الحبيبات ، استنشق الحجم المطلوب من المادة الطافية. اضبط مستوى الصوت على 50 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للصابونين.

ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة داخل الخلايا. أضف ميكرولتر واحد من كل جسم مضاد إلى آبار الخرزة المعنية ، واحتضن الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدون خلط ، أضف 150 ميكرولتر من الصابونين المؤقت إلى كل بئر يحتوي على عينات من الخلايا.

أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت إلى كل عنصر تحكم في التعويض جيدا لغسل الخرز. بمجرد طرد اللوحة ، أعد تعليق حبيبات الخلية والتحكم في 200 ميكرولتر من الصابونين المؤقت والمخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت ، على التوالي. قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 جرام لمدة ست دقائق عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق كل من عينات الخلايا وعناصر التحكم في التعويض في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت. انقل المعلقات إلى أنابيب فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت المسماة. حدد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية مجموعة دبقية صغيرة مميزة منفصلة عن أنواع خلايا الدماغ الأخرى بناء على ملفات تعريف النسخ.

كشف تحليل التعبير التفاضلي عن جينات غير منظمة بشكل كبير في الخلايا الدبقية الصغيرة ، بما في ذلك Csf1r و Fcrls و Fyb و Adap2 و P2ry12. تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بنجاح من عينات الدماغ الحية بناء على تعبيرها المميز عن علامات CD45 و CD11b. تم تحديد المجموعات السكانية الفرعية المميزة للدبقيات الدبقية الصغيرة بناء على مجموعات من علامات التنشيط ، بما في ذلك CD80 و CD86 و iNOS و CD206 و Arg1 و CD86 و CD64 و CD163 مع CD206.

تم توطين التعبير الجيني للعلامة ل Ptprc و Itgam على وجه التحديد إلى الكتلة الدبقية الصغيرة في إسقاط umap ، مما يؤكد هوية هذه الخلايا. أظهر تحليل مخطط الكمان تعبيرا أقل عن العلامات المضادة للالتهابات ، مثل Fcgr1 و Cd86 ، في الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة مقارنة بالتحكم في السيارة.