طريقة الميكروبيدات المغناطيسية السريعة للتنقية الفعالة للعدلات منخفضة الكثافة

ندرس العدلات منخفضة الكثافة داخل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية لتوصيف وظائفها وتحديد دورها في الأمراض المختلفة. العدلات منخفضة الكثافة نادرة في الدم السليم، لكنها تزداد بشكل ملحوظ في أمراض مثل الذئبة الحمراء الجهازية والسرطان. للبدء، أضف 10 وحدات لكل ملليلتر من الهيبارين كمضاد للتخثر في أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 15 ملليتر.

ثم أضف ملليلترين من 6٪ ديكستران T500 في PBS. احصل على 10 ملليلتر من دم من متطوع بالغ سليم عن طريق الوردة الوريدية. في أنبوب طرد مركزي جديد آخر بسعة 15 ملليتر، أضف خمسة مليليتر من وسط تدرج الكثافة.

قم بعمل الماصة بعناية دون لمس كريات الدم الحمراء وطبقها فوق الوسط لتشكيل مرحلتين منفصلتين. قم بطرد المركزي في الأنبوب عند 516 جرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لعزل PBMCs، يتم سحب وتخلص البلازما فوق نطاق PBMC دون إزعاج الخلايا.

اجمع نطاق الخلية أحادية النواة بين البلازما والوسط، مما يقلل من تجمع الوسط. أضف 20 ملليلتر من PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على PBMCs، ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 400 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استنشق السائل العلوي بحذر وكشط الأنبوب لفصل الحبيبة.

أضف 10 ملليلتر من PBS البارد لإعادة تعليق الخلايا. لعزل العدلات، قم بكشط الأنبوب لفصل الخلايا بعد تفريغ الوسط. ثم أضف 10 ملليلتر من PBS البارد.

الآن انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد بسعة 50 ملليلتر وجهاز طرد مركزي. استنشق السوبرناتينت وكشط الأنبوب مرة أخرى. الآن ضع الماصة بمقدار 10 ملليلتر من محلول منخفض التوتر البارد داخل الأنبوب وامزجه بلطف.

اخلط بلطف لمدة دقيقة واحدة بالضبط. أضف بسرعة 10 ملليلتر من محلول البارد عالي التوتر لجعل المحلول متساوي التون. ثم عد العدلات باستخدام غرفة نيوباور وتأكد من أن النقاء أعلى من 95٪، قم بالطرد المركزي بنظام التعليق للحصول على حبيبة خلية.

ثم أعد تعليق الحبيبات في PBS البارد. قم بطرد مركزي خلايا الدم المحيطية أحادية النواة عند 400 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة السوبرناتان، أعد تعليق الخلايا في 120 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.

ثم قم بتوصيل 35 ميكرولتر من الميكروبيدات المغناطيسية CD66b إلى تعليق الخلية. حضن الخليط في الظلام عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. الآن استخدم ماصة ملليتر واحد من محلول الغسل البارد على الأنبوب.

قم بطرد مركزي الأنبوب بقوة 400 جرام لمدة ثلاث دقائق. كشط الأنبوب لفصل حبيبات الخلية بعد إزالة السوبرناتان. وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول الغسيل.

ضع عمود فاصل مغناطيسي على مغناطيس. أضف 0.5 ملليلتر من محلول الغسيل إلى العمود، مما يسمح له بالمرور بالكامل. انقل ملليتر واحد من الخلايا المعلقة إلى العمود ودع المخزن يمر قطرة قطرة.

بعد الغسيل، انقل العمود إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم قم بعمل ماصة بميضية واحدة مليلتر من مخزن الغسيل في العمود. الآن ضع المكبس فوق العمود.

اضغط بلطف لخروج الخلايا. ثم أزل المكبس وضع العمود على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف ملليتر آخر من حاجز الغسيل إلى العمود.

ثم أدخل المكبس مرة أخرى واضغط بلطف لإزالة الخلايا المتبقية. قم بالطرد المركزي في أنبوبي الطرد المركزي الدقيق بوزن 800 جرام لمدة ثلاث دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلايا من كلا الأنبوبين إلى ملليلتر واحد من PBS البارد.

أبق الزنزانة معلقة على الثلج. أعد تعليق الخلايا المنقاة في مخزن وسم مصنوع من مصل البقري الجيني بنسبة 1٪ في PBS. انقل 250 ميكرولتر من نظام التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر.

أضف الأجسام المضادة المقابلة ضد جزيئات غشاء العدلات إلى الأنبوب. ثم حضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. الآن استخدم الماصة بميلي لتر واحد من PBS إلى الأنبوب.

قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي دقيق بوزن 800 جرام لمدة ثلاث دقائق. استنشق السوبرناتانت. اضغط على الأنبوب لكسر الحبيبة.

وإعادة تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من 1٪ بارافورمالديهايد. ثم أبق الخلايا عند أربع درجات مئوية، محمية من الضوء حتى يتم تحليلها بواسطة قياس خلوي التدفق. تحليل العينات باستخدام قياس تدفق الخلويات، مع التقاط 10,000 حدث لكل عينة.

مثلت العدلات منخفضة الكثافة لدى الأفراد الأصحاء حوالي 5٪ من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة، بينما أسفر بروتوكول العزل المغناطيسي الموصوف عن عدلات منخفضة الكثافة عند حوالي 98٪ من التعافي. تعبر العدلات عن علامات الغشاء CD10، CD11b، CD15، CD62L، وCD66b. تعبر العدلات منخفضة الكثافة المنقاء مغناطيسيا عن نفس علامات الغشاء التي تعبر عنها العدلات.

أظهرت العدلات منخفضة الكثافة المنقاء نواة متعددة الفصوص وكانت مشابهة في الحجم للعدلات. كل من العدلات والعدلات منخفضة الكثافة تولد أنواعا تفاعلية من الأكسجين استجابة لتحفيز PMA، بينما تنتج العدلات منخفضة الكثافة مستويات أعلى من النيوتروفيلات. أطلقت العدلات منخفضة الكثافة مصائد خارج الخلايا للعدلات استجابة لتحفيز PMA كما يتضح من تداخل الحمض النووي مع الإيلاستاز والسيترولين.

كل من العدلات المنقاء والعدلات منخفضة الكثافة أطلقت NETs ذات حركية وكميات متشابهة بعد علاج PMA. يوفر بروتوكولنا طريقة سريعة وقابلة للتكرار للحصول على النيوتروفيلات منخفضة الكثافة نقية ووظيفية للغاية. نعالج نقص بروتوكول موحد وفعال في الوقت لعزل العدلات منخفضة الكثافة من دم الإنسان.

هذا البروتوكول لا يتطلب تدريبا خاصا للآلات المعقدة، كما أنه أكثر اقتصادية وأسرع من FACS.