تحليل بنية RNA مقارنة للنسخ الناشئة والناضجة في Saccharomyces cerevisiae

درسنا معالجة الحمض النووي الريبي الكاترانسكريبشني، ويشمل ذلك كيف ينطوي الحمض النووي الريبي الناشئ عند خروجه من بوليميراز الحمض النووي الريبي الذي يصنعه. قبل هذه الطريقة، لم نكن قادرين على مراقبة كيفية طي الحمض النووي الريبي أثناء التخليق، وكان هذا يعيقنا في أبحاثنا. لذا فإن هذه الطريقة الجديدة تتغلب على تلك الثغرات.

تم تطوير CoSTseq لدراسة طي الحمض النووي الريبي الناشئ في الخميرة. وهو فعال بشكل خاص في تحليل الحمض النووي الريبي عالي الوفرة. للبدء، قم بتطعيم سلالة Saccharomyces cerevisiae BY4741 في 50 ملليلتر من وسط YPAD وحضن عند 30 درجة مئوية مع هز بسرعة 200 دورة في الدقيقة حتى تصل الزراعة إلى مرحلة منتصف اللوغار.

اجمع حوالي ثلاثة ملليلتر من زراعة الخميرة التي تعادل 1.8 وحدة كثافة بصرية وجهاز طرد مركزي عند 2,500 x جرام لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا. تخلص من المادة الفائقة في حاوية نفايات. أعد تعليق الحبيبة في 10 ملليتر من PBS البارد واستخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 2,500 x g لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية.

أزل الفائق الشفاف واحتفظ بحبيبات الخميرة على الثلج. أعد تعليق حبيبات الخميرة بحذر في 10 ملليلتر من الساركوسيل البارد 0.5٪ دون تكوين فقاعات. حضن الخميرة المعلقة على الثلج لمدة 20 دقيقة للسماح بالنفاذ، ثم قم بتكسير الخلايا بحرارة 400 × جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وأعد تعليق الخلايا النفاذية في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز باستخدام ماصة P-1000.

جهز محلول عمل من مخزن النسخ 2.5X مع ديثيوثرايتول مضاف حديثا بخمسة مليموللار، وسخن مخزن استكشاف هيكلي بمقدار 2.5X إلى 30 درجة مئوية. في أنبوب نظيف بسعة ملليتر، أضف جميع مكونات التفاعل المطلوبة وامزج جيدا. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من خلايا الخميرة المحضرة إلى أنبوب التفاعل وحضنها في الخلاط الحراري المضبوط على 30 درجة مئوية، مع هز 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين.

ثم أضف بسرعة 200 ميكرولتر من مخزن استطلاع البنية المسخن مسبقا بمقدار 2.5X، و25 ميكرولتر من كاشف كبريتات ثنائي ميثيل في نفس الوقت. قم بتدوير الأنبوب بلطف على دفعتين وأعده إلى الحاضنة المضبوطة على 30 درجة مئوية و500 دورة في الدقيقة. استمر في الحضانة على الخلاط الحراري لمدة أربع دقائق، مع تباعد 30 ثانية بين العينات.

جهز معصرات التوقف والغسل مسبقا وضعها على الثلج حتى الاستخدام. أوقف مثيلة ثنائي ميثيل كبريتات عن طريق إضافة ملليلتر واحد من محلول الإيقاف إلى أنبوب التفاعل. الآن قم بطرد المركزي بعينات الموسومة بصبغة ثنائي ميثيل على حرارة 3,500 × جرام لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي قبل التبريد.

بعد الدوران، تخلص من المادة الفائقة في وعاء نفايات مناسب. أضف ملليتر واحد من محلول الغسل المبرد إلى الحبيبة وأعد تعليقها. كرر الطرد المركزي عند 3,500 × جرام لمدة خمس دقائق.

تابع فورا إلى استخراج الحمض النووي الريبي ولا تجمد حبيبات الخميرة. أعد تعليق حبيبات الخميرة الموسومة بثنائي ميثيل كبريتات في 600 ميكرولتر من مخزن تحلل RNA، ثم انقل التعليق إلى أنبوب يحتوي على 40 ميكرولتر من 20٪ صوديوم دوديسيل كبريت. حضن العينة عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع هز بمعدل 950 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك، قم باستخراج الفينول-كلوروفورم من الحمض النووي الريبي وفقا للإجراء القياسي. قم بتدوير خرز السترابتافيدين المغناطيسي ونقل 44 ميكرولتر من الخرزات إلى أنبوب جديد لكل عينة تحتوي على 80 ميكروغرام من إجمالي RNA. ضع الخرزات المغناطيسية على رف مغناطيسي حتى تستقر الخرز.

بعد إزالة مخزن التخزين، أعد تعليق الخرزات في ملليلتر واحد من مخزن الغسل المسبق A. الآن حضن التعليق لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتمغنيط وإزالة السوبرناتانت. بعد الغسيل، أعد تعليق الخرز في 88 ميكرولتر من محلول ربط 2X. انقل 80 ميكرولتر من التعليق إلى أنبوب معقم بسعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 80 ميكروغرام من عينة RNA بيوتينيلية في 80 ميكرولتر.

قم بتدوير خليط عينة الخرزات على جهاز دوار لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لجمع التدفق الذي يحتوي على RNA ناضج وحفظه للهطول لإجراء اختيار بولي-A من RNA الناضج باستخدام سير DMS-MaPseq. بعد ذلك، اشطف مركب الحمض النووي الريبي الناشئ مرتين بسعة 500 ميكرولتر من محلول الملح العالي.

ثم اشطف مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من محلول ربط 1X، ثم شطف أخير ب 500 ميكرولتر من محلول منخفض الملح. الآن أضف 300 ميكرولتر من مادة RNA إلى مركب RNA الناشئ/الحبيبة، أعد تعليقها جيدا وحضن على الخلاط الحراري لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 60 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف 60 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة وحضن لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بطرد العينة بضغط 14,000 x g لمدة خمس دقائق في جهاز الطرد المركزي قبل التبريد. وأخيرا، نقل الطور المائي العلوي بحوالي 180 ميكرولتر إلى أنبوب تجميع جديد. تخلص من الطور العضوي المتبقي، تاركا الخرزات والمحلول المائي المتبقي.

بعد تنقية الحمض النووي الريبي الناشئ، قم بإعادة النسخ العكسي بتبديل القالب، وربط محول 5'، واختيار المكتبات للتسلسل. أظهر تصور منتجات PCR على هلام 1٪ أغاروز تكوين بسيط لدايمر البادئات ومسحة مميزة حوالي 300 زوج قاعدي لتتبع البنية المطابقة أو مكتبات CoSTseq وDMS-MaPseq. أكد تخطيط الإلكتروفيرجرام لعينة CoSTseq الأولى توزيع حجم المكتبة مع ذروة حوالي 285 زوجا من القاعدات.

كشف محاذاة القراءة لجهاز mRNA في ASC1 أن مكتبة CoSTseq تضمنت تغطية عبر الإنترون، مما يؤكد أن الحمض النووي الريبي لا يزال في الناشئة. بينما مكتبة DMS-MaPseq كانت تفتقر إلى تغطية الإنترونات، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي ناضج. كشفت مصفوفة الطي النسخي لمرحلة النوم الصبغي لما قبل 18S من الحمض النووي الريبي أن تفاعل DMS أظهر تغيرات مفاجئة مع تقدم بوليميراز الرينا من الموقع 790 إلى 811 على طول موقع rDNA.

أظهر تحليل تفاعلية DMS لmRNA ل ADH1 ملفات مماثلة بين الأشكال الناشئة والناضجة، مما يشير إلى مناطق من الاستقرار الهيكلي. على النقيض من ذلك، أظهر mRNA ل SSA2 مناطق من تفاعل DMS مختلف بين الأشكال الناشئة والناضجة، مما يشير إلى تغييرات هيكلية أثناء النضج. باستخدام CoSTseq، يمكن للباحثين تحديد البنى الثانوية للحمض النووي الريبي الناشئ في الجسم الحي وموقع بوليميراز RNA على متن نسخ RNA.

CoSTseq لديها خطوات حساسة للوقت، وتستخدم مواد كيميائية سامة. من الأفضل معالجة عينتين في نفس الوقت كحد لا يتجاوز الأدوار. من إجمالي الحمض النووي الريبي الناتج من CoSTseq، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي غير البيوتينيل للفحص البنوي الناضج المتزامن باستخدام DMS-MaPseq التقليدي.