测量 秀丽隐杆线虫 固体培养基上的寿命测定

为了测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命，需通过定时产卵法获得年龄同步化的群体。将活跃的成年雌雄同体线虫转移到接种了经紫外线灭活的大肠杆菌（E. coli）的线虫生长培养基（NGM）平板上，使其产卵6至8小时，随后移除成虫。接下来两天内，线虫从这些卵中孵化并发育至L4幼虫阶段。将L4阶段的线虫转移至含有氨苄青霉素（ampicillin）以防止活菌污染、以及氟脱氧尿苷（FUDR）以抑制繁殖的新NGM平板上，让其继续发育为成虫。

从此时起，每隔两到三天观察一次成虫，直至所有蠕虫死亡。在每个时间点，将死亡的蠕虫从培养皿中移除，并记录存活和死亡蠕虫的数量。我是乔治·塞顿（George Seton），来自华盛顿大学病理学系马特·卡普林（Matt Capline）实验室。

今天我们将向您展示如何测量寿命并观察我们的秀丽隐杆线虫。我们在实验室中使用该方法来研究衰老的遗传学机制。那么，让我们开始吧。

一个基本的寿命实验需要两种类型的培养皿：标准NGM培养皿（不含任何添加剂）和AMP FUDR培养皿（在NGM中添加氨苄青霉素和氟脱氧尿苷）。这两种培养皿均接种大肠杆菌OP50菌株，随后通过紫外照射将其灭活。首先配制10毫升NGM溶液。

每60毫米的培养皿，将固体NGM在微波炉中高火加热32次脉冲，直至完全融化。每次脉冲之间轻轻摇动培养基，防止压力气体积聚。将液态NGM置于55摄氏度的水浴中或实验台上，使其冷却。当培养基冷却至55摄氏度时（此时可用手直接握住玻璃容器而无烫感），即可加入药物。

对于含药物的培养板，每100毫升NGM培养基中加入33微升150毫摩尔的FUDR和100微升100毫克/毫升的氨苄青霉素，轻轻旋转混匀。氨苄青霉素用于防止外来细菌污染，FUDR用于防止虫卵孵化，因此无需每隔几天转移线虫以将其与生长中的幼虫分离。

现在倒入培养基，将平板置于实验台上晾干两天。在平板完全干燥的前一天，用大肠杆菌 OP50 在 LB 琼脂平板上新鲜划线培养所得的单菌落，接种液体 LB 培养基。每 60 毫米平板至少准备 0.5 毫升培养物。

将OP 50菌种置于37摄氏度摇床中，使细菌过夜培养。次日，以3,500 ×g离心力离心10分钟，收集OP 50细菌沉淀。弃去上清液至足以将细菌重悬为10倍浓度的体积。

现在，向每个培养皿中接种 100 µL 浓缩菌液。避免移液器枪头接触 NGM 培养基表面，因为培养基表面的缺陷会导致线虫钻入其中。轻轻旋转培养皿，使细菌均匀分布在 NGM 培养基中央区域，但不靠近培养皿壁。将培养皿置于实验台上静置干燥 24 小时。干燥后，用足够强的紫外线剂量照射培养皿表面，以抑制细菌生长；我们使用的是 Strata Gene UV Straddle Linker 2, 400。

首先将未加盖的培养板放入跨接连接器中。然后按下能量键，在键盘上输入 9 9 9 9，再按下启动键。

将平板置于紫外线下照射约五分钟。经紫外线杀死细菌的平板可倒置存放于四摄氏度环境中，最长可保存一个月。本部分描述如何获得具有相同孵化日期的线虫群体。

首先，将约20条年轻成虫线虫转移至不含药物的新鲜NGM平板上。将平板置于25摄氏度条件下培养约一周，使线虫繁殖并消耗完平板上的全部细菌食物。在发育停滞的dauer阶段新孵化出的线虫出现后，应转移20至30条dauer幼虫至另一不含药物的新鲜NGM平板上，并在有食物的条件下于25摄氏度继续培养。

这些幼虫将在两天内发育为具有生殖活性的成虫，并在此后数天内保持生殖活性。现在将10至15只具有生殖活性的成虫转移至不含药物的新鲜NGM平板上。该平板被称为定时产卵板或TEL平板。

将TEL板置于25摄氏度环境中，使线虫产卵。从这些卵孵化出的个体将作为实验动物，并在六小时后开始记录其寿命。检查TEL板上是否有卵。

如果卵的数量尚不足，可将 TEL 培养板置于 25 摄氏度下最多再放置 24 小时，期间定期检查是否有卵。当已产下足够数量的卵后，移除 TEL 培养板中的成虫。

典型的寿命实验每个实验组需要 30 至 90 个卵，但单个 TEL 平板可产生数百个卵。10 至 15 只具有生殖活性的成虫在 6 至 8 小时内可产下约 150 个卵。在比较实验组时，若寿命差异较大，仅需 30 只动物即可达到统计学显著性。

应使用更多的动物以区分更细微的差异。现在将不含成虫的 TEL 平板置于 20 摄氏度，直至卵孵化且线虫发育至 L4 幼虫阶段。对于野生型 C. elegans，这通常需要两天时间，但对于具有发育迟缓表型的品系，则可能需要更长时间。

本部分介绍如何追踪一个年龄同步化群体的生命周期。首先，将TEL平板上的L4幼虫转移至含有AMP和FUDR的平板中。对于每种待测菌株或实验条件，通常设置两到三个平板，每个平板接种25至30条线虫。

将AMP FUDR平板在20摄氏度下孵育24小时。随后肉眼观察线虫、培养基和细菌，将线虫转移至新鲜的AMP FUDR平板。如果线虫已摄食了大部分细菌食物，通常每周需转移一次或两次。

实验初期，若观察到有大量幼虫存在，通常表明线虫是在年轻成虫阶段而非L4幼虫阶段被转移到含AMP和FUDR的培养板上的。年轻成虫可能在FUDR发挥作用之前产卵，偶尔会有幼虫逃逸FUDR的作用并发育为成虫。这些幼虫会干扰实验结果，此时应将成虫转移到新的培养板上，并丢弃含有幼虫的旧培养板。

如果观察到有活的正在生长的细菌，也应将线虫转移到新的培养皿中。通常情况下，AMP 与 UV 灭活相结合可确保实验中无活细菌污染，但偶尔仍会发生。此外，还需转移线虫。

如果在培养基上观察到真菌生长。若能及早发现，可使用移液器吸头或刮铲将真菌切除。一旦真菌生长至直径数毫米以上，通常更方便的做法是将线虫转移至新的培养板中。

每两到三天使用解剖显微镜对所有线虫进行一次寿命评分，判断每条线虫是存活还是死亡。

轻轻敲击培养皿。若线虫对敲击有移动反应，则表明其存活。若线虫对培养皿的敲击无反应，应放大观察头部区域，用铂金转移针轻轻触碰线虫头部。

将线虫记为死亡。若其头部无任何移动反应，则将死亡的线虫从培养皿中移除。检查完所有线虫后，记录日期以及存活和死亡的线虫数量。

在固体培养基上培养的线虫偶尔会通过钻入或沿器壁爬行逃逸出培养板表面。逃逸的线虫将被完全排除在研究之外。实验结束后，将培养板放回20°C恒温培养箱中。

再等待两到三天，然后再次检查培养皿。持续此操作，直到所有线虫均死亡。通常将每天死亡的线虫数量取倒数，以计算每天存活线虫的比例，并以定时产卵日为起点，将该数据绘制成生存曲线图。

第0天。在20摄氏度条件下，以UV灭活的细菌饲喂的N2秀丽隐杆线虫野生型品系，从卵孵化起计的典型中位寿命约为25天。

我们刚刚向您展示了如何测量寿命并观察运动能力。您可以修改这一基本操作流程，以测试多种环境条件，包括饮食限制和RNA干扰，相关内容在补充文本中有所讨论。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。