复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

已有数百个基因被发现其功能会影响生物体的衰老过程，但其中许多基因之间的关系仍不清楚。该方法有助于回答衰老研究领域的一个关键问题。

即，gerA 基因之间的遗传相互关系是什么？该技术的主要优势在于通量的提升，可同时进行定量测量的遗传扰动数量至少提高了一个数量级。采用本方法收集的寿命数据，可使用本文随附提供的软件进行绘图和分析。

除了可用于研究寿命外，该方法还可应用于其他与年龄相关的表型，例如应激抗性以及健康状况的变化。对于本实验步骤，需制备一份新的RNAi亚文库的平板。首先，使用12通道移液器将含氨苄青霉素的LB培养基各200微升分装至96孔板的每个孔中。

将96针平板复制器依次浸入50%次氯酸钠溶液中，随后浸入超纯水中，以对针头进行灭菌。然后将针尖浸入乙醇中，并小心地用火焰灼烧针尖。接着，小心移除冷冻的96孔甘油保存库板的粘性封口膜，将已灭菌的平板复制器针尖轻轻但牢固地压入仍处于冷冻状态的甘油保存孔中。

然后接种培养物，并用透气膜密封接种好的平板。将培养物置于实验台面上过夜培养。次日，对平板复制器进行灭菌处理，小心移除过夜培养物的密封膜，将复制器针头浸入培养物中。

接下来，用接种针接种含有氨苄青霉素和四环素的矩形 LB 琼脂平板。施加均匀压力，并采用小范围的环形动作转移细菌，避免菌落过于密集。随后，将平板在 37 摄氏度下过夜培养。

第二天，每需要10块复制平板，向一个深孔96孔板的每个孔中加入1.5毫升含氨苄青霉素的LB培养基。接着，将培养的细菌接种至各孔中。然后，用透气膜密封该板，在振荡条件下培养20小时。

对照孔应分散分布在96孔板中，使得当96孔次级文库板被分为每组24孔时，每组24孔中均包含每种对照各一个。次日，使用带可调枪头间距的六通道移液器，将120微升的培养物等分试样加入24孔板中。然后，将板置于超净工作台中敞口干燥，直至所有液体被完全吸收。

切勿让其过度干燥。在分装液体培养物时，务必保持注意力集中，以确保将正确的细菌培养物加入24孔板中的相应孔内。复制组实验始于一组独立的24孔重复培养板，每块板均接种相同的细菌RNAi克隆。

进行寿命实验时，每个孔中加入15至20只L1期动物，使其生长至L4期。在L4期时，向所有重复组的孔中加入FUdR。同一天的晚些时候，可从该组中取出一个重复板，作为第一个时间点进行计数。

为了评估寿命，向培养板的孔中加入液体以诱导动物运动。对未开始运动的动物，用线虫挑针轻轻触碰刺激。随后记录动物总数以及死亡动物数量。

首次观察后的培养皿随即弃用。在下一次观察时间点，从培养皿组中取出另一份重复样品，以相同方式评分。此过程按照预定的评分间隔重复进行。

每次使用复制组中的新培养板。持续评分一组培养板，直至无存活动物为止。首先，采用与传统寿命测定实验相同的基于次氯酸钠处理的制备方法，同步化动物群体。

然后，使用六孔可调间距移液器和试剂储液槽，将15至20只L1期动物接种到已准备好的24孔板的每个孔中。在接种过程中，需定期混匀L1期动物悬液，以保持分布均匀。接着，让动物发育至L4期。本实验方案必须明确掌握L4期发育的时间。

定期观察线虫的发育情况。当线虫发育至L4期时，向每孔加入24 µL的50倍浓缩FUdR溶液，并将培养板放回培养箱。使用L4期的线虫至关重要。

如果雌雄同体在线虫达到生殖成熟之前加入氟脱氧尿苷（FUdR），其子代将存活并摄食食物。相反，过早加入FUdR会导致线虫破裂。在预定的时间点，使用一个重复平板来评估存活率。

为此，用 M9 溶液浸没孔板。每天评估存活率之前，剔除无食物、出现污染或含有形态学或发育缺陷个体的孔。记录每个孔中的线虫总数，并用线虫挑针轻轻触碰头部，检查不移动线虫的状态。

计数完培养皿中所有不移动的死亡个体后，弃去该培养皿。进行此操作时，需将转化后的 e. Coli 在含氨苄青霉素的 LB 培养基中过夜培养。

第二天，将细菌在 3,000 ×g 条件下离心 15 至 20 分钟进行浓缩。用起始体积 1/10 的溶液重新悬浮细菌。接着，将 200 微升的 10 倍浓缩细菌分装至六厘米培养皿中。

每种测试条件准备三到四个平板，并额外准备两个平板以备污染时使用。将平板置于超净工作台中干燥，直至所有液体被吸收或蒸发。干燥后，将平板置于塑料盒中，在室温下存放过夜，以诱导双链RNA的产生。

然后，将培养板在4°C下保存最多两周。对于线虫，用M9缓冲液收集带有卵的成虫，用M9缓冲液洗涤两次，每次均重复离心并吸除上清。随后，将秀丽隐杆线虫（C.elegans）重悬于4 mL M9缓冲液中，并加入2 mL次氯酸盐溶液。

现在，立即将线虫涡旋振荡3分钟，并周期性地剧烈震荡。然后，在解剖显微镜下观察是否有成团的卵出现。如果未观察到卵团，则继续将线虫涡旋振荡额外10至20秒。

接下来，用M9快速清洗卵，重复两次，方法同前。然后将清洗后的卵重悬于3毫升M9中。接着，将卵转移至一个新的15毫升离心管中，在20°C下轻轻旋转孵育，并让胚胎过夜孵化。第二天，通过计算三个10微升液滴中每个微升L1期幼虫的平均数量，确定所制备L1溶液的密度。

将制备好的接种细菌的培养皿中分别放入50只L1期动物，在20°C培养箱中培养，直至胚胎发育至L4期。从L1期发育至L4期的正常发育过程约需40小时。

然后，为了防止子代产生，向每个培养板中加入 160 微升 50 倍浓度的 FUdR。接着移除雄性个体，因为寿命测定通常仅针对雌雄同体进行。操作完成后，将培养板重新放回 20 °C 的培养箱中。

在所有线虫死亡之前，每天对它们的存活情况进行评分。操作时，用铂金丝或睫毛轻轻触碰每个不移动的线虫头部。无反应的个体视为已死亡，需从培养皿中移除。

在本实验过程中，注意记录任何异常情况。使用复制平板法和传统方法检测野生型 N2 动物的秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命时，结果相似。例如，通过饲喂法进行 RNAi 沉默 mml-1 或 mxl-2 基因，可显著缩短正常寿命。

这通过传统的寿命测定实验和复制平板实验两种方法进行了测量。也可以检测到寿命的延长。如图所示，无论采用哪种方法测定，对 mdl-1 或 mxl-1 进行 RNAi 均显著延长了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命。

利用复制平板法，可以同时量化超过100种条件下寿命的变化，而采用更传统的方法则难以实现。例如，一项基于喂食的全基因组RNAi筛选鉴定出159个基因，这些基因对于因降低daf-2类胰岛素信号通路而延长的寿命至关重要。通过测量动物的健康寿命，进一步阐明了类胰岛素信号通路与这些基因之间的关系。

健康状况通过秀丽隐杆线虫（C. elegans）在溶液中悬浮时的摆动情况来判断。观看本视频后，您应充分了解如何利用基于摄食的RNAi技术来测定秀丽隐杆线虫的寿命。

但RNAi具有多功能性，可应用于多种不同的表型。一旦掌握，若操作得当，利用复制平板法每天可评估超过100个RNAi克隆的寿命。早期和晚期时间点均可快速评分。

孔板中的所有动物要么存活且能够活动，要么已经死亡。当动物开始死亡时，评分所需时间最长。因此，在安排独立实验时，应考虑到这一点，错开实验设置时间。