使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

那么，TeeR 检测真正独特之处在于它能够直接可视化抗原特异性的 T 细胞。这个 te，即 TeeR，是我们检测方法中最独特的部分，再结合我们所进行的扩增步骤。

我们知道，首先分离T细胞，然后在一种能够富集我们感兴趣T细胞的环境中进行培养。接着，我们能够对这些特定细胞进行特异性标记，并通过流式细胞仪进行可视化检测。而在此前的检测方法中，例如已经使用数十年的CFSE增殖实验，所获得的仅仅是整个T细胞群体总体的宏观测量结果。

但人体内有数百万个T细胞，它们能够识别各种各样的模式。如果你足够幸运，可能在每20万到30万个细胞中才会找到一个你正在寻找的目标细胞。因此，这种检测方法需要进行富集步骤。

然后通过检测数量，由于是直接染色，你实际上可以在背景之外观察到占细胞总数不到1%的细胞群体。因此，你可以发现非常微小的差异，并能够相对精确地计数血液样本中、即该个体中能够识别你所关注模式的T细胞数量。但这还远未结束，因为四聚体还允许你不仅标记这些T细胞，而且能够将它们分离出来用于进一步分析。

你们所使用的四聚体实际上是在BRI这里制备的，是这样吗？是的。我们是全国极少数能够成功制备II类四聚体的实验室之一。我们的目标是以成本价将这些试剂提供给任何有意引进该技术的实验室。

您认为在其他实验室中重复该检测时，最具挑战性或最困难的方面是什么？嗯，我认为主要有两点，首先是T细胞的培养。这确实有点像一门艺术。

您每天几乎都需要做出决定，判断细胞是否需要额外的营养物质或更大的生长空间。而我认为，对于缺乏经验的操作者来说，第二个可能最难的部分是数据分析：需要判断信号中的哪一部分确实是阳性反应，而哪一部分仅仅是物理作用或非特异性吸附所固有的背景信号。

而且，所有物质在某种程度上都具有一定的黏附性，这一点同样需要大量经验才能掌握，尤其是在整体反应较弱的情况下。目前，您通过该检测所获得的信息，对患者可能带来哪些益处？在自身免疫性疾病患者中，最早出现的标志性特征之一就是一组针对该疾病的特异性抗体谱。

根据免疫学的基本原理，我们知道，只要有抗体反应，必然首先存在T细胞反应。因此，如果我们能够观察处于风险中的个体，检测到在抗体形成之前出现的T细胞活性升高，这将有助于我们定义一种新的风险层级，识别出即将产生自身抗体的个体，从而有望为干预性治疗打开一个时间窗口。该实验方案将纯化并扩增抗原特异性的CD4阳性T细胞，并利用四聚体试剂和II级层流生物安全柜等设备对这些细胞进行可视化检测。

这将是实验操作的主要工作区。50 毫升锥形管，用于 PBMC 分离的主要试管，一份 XPBS。XPBS 应不含钙和镁，用铝箔包裹以避光。移液器辅助装置，CoStar 10 毫升移液管，配有 50 毫升插入件的气溶胶防护容器，用于防止血液污染离心机。

GS six R 离心机，移液管，巴斯德移液管，溶血缓冲液，每升含 8.3 克氯化铵、1.0 克碳酸氢钠、0.04 克二水合 EDTA 三钠，PBS 中含 0.2% 台盼蓝溶液，血细胞计数仪，15 毫升锥形管，运行缓冲液含 PBS 并添加 2 毫摩尔 EDTA 和 5 克每升的 BSA。

BSA max CD 四分离试剂盒二购自 Milin 生物技术公司，EP 磁力架购自干细胞技术公司。其他磁性细胞富集平台也可使用，且具有同等效果。5 毫升聚丙烯管，RPMI 1640 培养基添加 25 毫摩尔 HEPES 用于制备 T 细胞培养基，混合人血清用于补充 T 细胞培养基，Pen-Strep 用于补充 T 细胞培养基，500 毫升 0.22 微米瓶顶滤器，无菌 48 孔板用于体外扩增培养，37 摄氏度 CO2 培养箱，20 毫克/毫升含目标表位的合成肽溶液。

使用5 mL聚苯乙烯流式管，装载肽段的II类四聚体用于可视化抗原特异性T细胞，抗CD3、抗CD4和抗CD25抗体用于包被抗原特异性T细胞。在开始实验前，使用Fax caliber流式细胞仪或同等设备。将所有材料和仪器组装至实验工作区。

以下演示将涵盖以下步骤：PBMC 的分离、CD4 阳性 T 细胞的分离、体外扩增培养，以及通过显微镜观察或染色对 T 细胞进行可视化。第一步：PBMC 分离。

采集血样。应使用注射器或采血管收集血液，并按1:50的比例加入肝素抗凝，以防止血液凝固，预计每毫升血液可获得约100万个外周血单个核细胞（PBMC），其中约40%为CD4阳性T细胞。

将血液分装至50毫升锥形管中，每管25毫升。在气液界面（ALI）凝固前轻轻混匀血液，以均匀分布血浆。

加入 PBS，使总体积达到 40 毫升，并通过将 11 毫升菲亚尔（fial）插入血清管中并小心地从移液管上取下移液器辅助装置来进行下层铺垫。菲亚尔将缓慢流入管底。待液面平衡后，缓慢将移液管从血清管中取出，弃去管帽，盖紧血清管，并将其转移至气溶胶罐中。

将罐体牢固关闭，并在无刹车条件下以900 × g离心20分钟。此步骤的关键在于离心结束时不得使用刹车，因为刹车产生的力量会扰动离心后形成的细胞层。单个核细胞（PBMC）应在上方黄色血浆层与下方透明液体层之间形成清晰的白色层。

使用移液管轻轻吸除白细胞层，并转移至新管中。此过程中可能会吸入部分血浆和菲可，但应避免吸入任何红细胞层。通常在此步骤可将两管血液合并至一个细胞管中。

为增大沉淀物体积，加入PBS使总体积达到15毫升，然后以500 × g离心15分钟（低刹车，防气溶胶），用移液管小心吸去上清液，注意不要扰动沉淀。每管加入5至6毫升溶血缓冲液进行处理，轻轻混匀以去除团块。孵育时间不得超过5分钟。

加入 PBS 至终体积为 50 毫升，于 230 × g 离心 10 分钟。低刹车条件下，气溶胶罐在这些较慢的离心中已不再需要。洗涤两次：使用移液管吸除液体，用 PBS 重悬菌体，于 230 × g 离心 10 分钟。在最后一次洗涤步骤前，取一部分重悬的细胞，用台盼蓝稀释，使用血细胞计数板进行计数。

细胞计数将决定T细胞分离过程中所用试剂的体积。第二步，CD4阳性T细胞分离：吸除液体，加入运行缓冲液，使总体积达到每1000万细胞40微升。通常需要加入30微升缓冲液加上残留沉淀的体积。

将此体积转移至一个15毫升锥形管中。加入CD4分离试剂盒中的抗体混合液，每1000万个细胞加入10微升，置于冰上孵育10分钟。从冰上取出管子，打开管盖，每1000万个细胞加入30微升运行缓冲液。

加入CD4分离试剂盒中的磁珠，每1000万个细胞使用20 µL，混匀后置于冰上15分钟。用10倍体积的运行缓冲液洗涤，并在230 × g下离心10分钟。

离心过程中，在实验区域准备好磁铁和5毫升聚丙烯管。用移液器吸去细胞沉淀中的液体，加入2毫升洗脱缓冲液，并用移液器去除团块。

使用同一支移液管将细胞转移至5 mL离心管中，并在磁力架上孵育15分钟。将磁力架翻转，小心地将CD4阳性T细胞组分倾入已标记的15 mL离心管中，注意保留最后一滴液体。向5 mL离心管中加入另外2 mL冲洗缓冲液，然后从磁力架上取下。

轻轻冲洗CD4阴性细胞，使其从管壁脱离，并转移至已标记的15毫升离心管中。每管加入2毫升T细胞培养基。取少量细胞悬液用于计数，然后以230 ×g离心10分钟。

用台盼蓝稀释细胞等分试样，并使用血细胞计数板进行计数。这些细胞计数结果将决定扩增培养所用的孔数。第三步。

根据细胞计数，分别对CD4阳性与CD4阴性细胞沉淀进行体外扩增培养并吸取培养液。向CD4阳性细胞中加入培养基，调整细胞浓度至每毫升300万个细胞。向CD4阴性细胞中加入培养基，调整细胞浓度至每毫升1000万个细胞。

扩增培养每孔需要 300 万 CD4 阴性细胞，以及每孔 200 至 300 万 CD4 阳性细胞。通常情况下，CD4 阳性细胞是限制性细胞群体。将 CD4 阴性细胞分装至 48 孔板的相应孔中。

每孔加入 300 微升，将培养板置于 37 摄氏度培养箱中孵育 1 小时。取出培养板，移除培养箱中的液体，通过每孔加入 500 微升新鲜培养基，并使用移液管轻柔吹打 12 至 20 次，然后吸去全部液体以洗涤孔板。此洗涤步骤将留下一层贴壁的抗原呈递细胞。

洗涤完成后，加入适量培养基以浸润每个孔的底部，大约 100 µL。否则，贴壁细胞将会干燥。如有必要，向每个孔中加入 200 万至 300 万个 CD4 阳性细胞。

加入额外的培养基，使每孔的总体积达到一毫升。向每孔加入所需的肽。刺激的典型浓度为每毫升10微克。

将最终的培养板置于37摄氏度培养箱中培养七天。七天后，从次日开始，每天向每孔加入50微升hemo IL-2。

使用显微镜监测细胞生长情况，对于尚未达到汇合的培养孔，移除一半培养基，加入新鲜培养基和 50 微升 IL；对于已汇合的培养孔，通过重悬细胞，将一半细胞转移至一个新的空孔中，加入新鲜培养基和 50 微升 IL，然后将细胞放回培养箱中继续培养。扩增的细胞在培养 13 至 15 天后即可用于 TEER 染色。

第四步，通过四聚体染色法可视化T细胞，购买或制备与肽段匹配的四聚体，用于刺激CD4阳性T细胞。从培养箱中取出培养板。

小心地从每个孔中吸出一半的培养基。通常将每个孔中的75微升或约50,000个细胞转移至一个5毫升的聚苯乙烯Fax管中，加入teer，通常每50微升总体积加入1微升，并在37°C培养箱中孵育1小时。建议同时将每个孔的另一份等分试样用不匹配的teer进行染色，作为阴性对照，并用抗CD3、抗CD4和抗CD25抗体标记细胞。

可使用其他或替代的抗体标记物。但请勿使用 PE 标记的抗体，因为目前该通道必须保留用于 teems。此外，使用额外的细胞标记任何单色或同型对照。

将抗体标记的细胞在4°C孵育15至30分钟。每管加入0.5至1毫升运行缓冲液洗涤，然后在230 × g离心10分钟。小心弃去上清液，使用参考微球、单色对照管、同型对照等校准流式细胞仪。

使用流式细胞仪分析每个试管。四聚体阳性细胞应在扩增的CD4阳性T细胞中形成一个明显独立的细胞群。四聚体阳性细胞通常为CD25阳性，且常为CD4高表达。