使用 gentleMACS 解离仪制备小鼠肺组织单细胞悬液的标准方案

在本视频方案中，您将看到如何使用 Gentle Max 对成年小鼠肺组织进行解离。在胶原酶 D 和 DNase I 存在下，将肺组织解离为单细胞悬液后，通过 70 微米细胞滤网过滤，离心并重悬，用于后续实验。您好，我是来自德国 Miltenyi Biotec 的 Melanie Mlu。

今天，我将向您展示一种利用GenX解离技术从小鼠肺组织制备单细胞悬液的可重复且自动化的操作流程。我们实验室使用该方法制备单细胞悬液，用于后续分离白细胞或内皮细胞。好了，让我们开始吧。

在开始实验方案之前，需要准备并备好几种标准溶液。首先，我们需要赫贝斯缓冲液。其次，需要含有100毫克/毫升酶和赫贝斯缓冲液的胶原酶D溶液。

第三，一种含有每毫升20,000单位的dase one溶液。最后，两种常用的缓冲溶液：pH为7.2的典型PBS缓冲液，以及由AutoMax冲洗液和BSA储备液配制而成的PEB缓冲液。

我们从一只六至七周龄的雌性活检小鼠中获取已解剖的肺组织，开始本实验方案。确保肺组织不带有邻近器官，如心脏和胸腺、进出肺的血管、气管以及结缔组织。将组织置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中冲洗，以去除红细胞。

通常，此年龄段小鼠的肺组织重量在110至150毫克之间。如果计划处理来自较年长动物或其他小鼠品系的肺组织，请称量组织和缓冲液体积。每管最多可处理450毫克组织。

将肺组织转移至已装有4.9毫升heis缓冲液的gentle max C管中。向肺组织和缓冲液中加入100微升胶原酶D溶液，使其终浓度达到每毫升2毫克。现在加入10微升dase。

每份超过150毫克的组织使用一种溶液。加入20微升的酶一溶液。确保C管紧密闭合，并将其倒置放在gentle max解离仪上。

确保组织位于转子和定子之间。选择肺组织程序，按下启动按钮开始运行，程序结束后取出C管，将样品孵育30分钟。

在37摄氏度培养箱中孵育期间，应使用最大混合管旋转仪旋转试管，或每5分钟手动翻转一次。孵育结束后，将C管放回轻柔最大解离仪中，运行第二个肺程序。程序运行期间，通过将50毫升试管的管盖替换为70微米孔径的细胞滤网，准备用于收集过滤后细胞的容器。当解离程序结束后，根据试管内样本物质的分布情况，可能需要短暂离心以浓缩样本物质。

可通过移液器穿过C管密封隔膜盖将解离的细胞从管中移出。使用合适的1000微升移液器吸头，将细胞悬液加入细胞筛中，以去除较大的颗粒或聚集体。待溶液流尽后，通过向细胞筛中再加入5毫升室温HEES缓冲液，洗涤细胞筛，使过滤后的细胞沉淀。

将50毫升离心管在300 ×g 条件下离心10分钟。弃去上清液，用所需体积的室温PEB缓冲液重悬细胞沉淀。

不要倾倒上清液。现在可以进行后续应用。使用本方案解离小鼠肺组织可获得高比例的活白细胞和内皮细胞。

将获得的单细胞悬液用CD45 PE以及CD146 FITC或CD31 FITC进行染色，并通过流式细胞术进行分析。该图显示了使用CD11c磁珠、一个minimax分离器和两个MS柱对树突状细胞进行富集的结果。好了，我刚刚向您展示了如何通过使用gentleMACS解离仪和C管，以标准化的方法从小鼠肺组织中制备单细胞悬液。

该方法可实现高效且温和的组织解离。进行此操作时，重要的是要正确解剖肺组织，并在解剖后立即处理组织。制备得到的单细胞悬液可用于后续实验。

例如，对细胞进行磁性标记，然后分离白细胞或内皮细胞。好了，就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。