利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

我们的实验室研究在不同耐受与免疫背景下CD4 T细胞的发育过程。在各项研究中，我们主要关注抗原暴露如何驱动T细胞表型亚群的发育，从而形成免疫记忆，以增强对自身抗原的耐受性或对病原体的免疫应答。近期，我们的研究重点集中在定位于肺组织中的调节性T细胞和记忆性T细胞亚群的发育过程。

这些组织驻留性T细胞在组织损伤期间对细胞抗原维持耐受性，或在再次感染时促进针对病原体的炎症反应中发挥重要作用。本实验室专注于抗原特异性T细胞的直接研究，使用定制的肽-MHC四聚体试剂。这使得我们能够在不依赖TCR转基因模型或其他已知可能引起实验假象的操作的情况下研究这些T细胞。

尽管我们可以利用四聚体直接鉴定抗原特异性T细胞，但这类T细胞通常频率极低，尤其是在处于初始或记忆状态时。此外，在免疫应答后，这些T细胞常驻留于非淋巴组织中，从中分离也颇具挑战性。虽然目前已有一些从小鼠肺组织中分离T细胞的成熟方案，但本文所介绍的方案已针对后续通过四聚体染色检测低频率抗原特异性T细胞进行了优化。

本方案中，我们还提供了两种组织解离方法，以更好地适应活体资源的需求。本方案将帮助研究人员扩展四聚体技术的应用，用于研究肺组织中的抗原特异性T细胞。这将推动对组织驻留记忆T细胞发育与功能更加强大的体内研究，而这些正是当前领域内备受关注的重要课题。

将一至三毫克荧光染料标记的抗小鼠 CD45 抗体溶于 100 毫升生理盐水中，静脉注射至每只麻醉小鼠体内。首先，为每只小鼠准备含有 4 毫升冰上预冷的 HEPES 缓冲液的专用组织解离管，并置于冰上。处死小鼠后，立即将切除的肺组织放入对应编号的、预先冰浴冷却的组织解离管中。

将试管放入自动组织解离仪中，并运行针对肺组织的第一个预设程序。然后向每支含有解离肺组织的试管中加入500 µL Liberase储存液和500 µL氨基胍储存液。在37°C条件下，于振荡混合器上孵育30分钟。

随后，将试管重新放回解离仪上，运行针对肺组织的第二个预设程序。接着，将组织解离管中的单细胞悬液通过100 µm细胞滤筛倒入50 mL锥形管中。用5 mL完全EHAA冲洗组织解离管，并将冲洗液经滤筛滤入50 mL试管中。

去除滤网后，用完全EHAA将细胞悬液的体积调至50毫升。无需使用专用的组织解离管，将切除的肺组织分别放入预冷的冰上放置的1.5毫升微量离心管中。待所有肺组织采集完毕后，将每份肺组织转移至不含任何细胞培养基的新微量离心管中。

使用剪刀在微量离心管内将肺组织剪成小片段。向每根试管中加入1毫升Liberase TM和DNase I消化液。在37摄氏度水浴中孵育30分钟。

然后将样品倒入置于50毫升锥形管上方的100微米细胞滤筛中。用移液器将剩余样品转移至滤筛上。使用无菌1毫升注射器推杆的橡胶端在滤膜上研磨组织。

用冷分选缓冲液冲洗滤网，最终在离心管中收集七毫升液体。无论采用自动还是手动解离方法，均需离心所获得的细胞悬液。小心吸除上清液，保留约100微升上清液及细胞沉淀。

最后，加入约100微升FC阻断液，使总体积达到200微升，并剧烈涡旋振荡以重悬细胞沉淀。首先，向分离的肺细胞中加入50微升抗小鼠CD90.2微珠。涡旋混匀后，在4摄氏度条件下孵育10分钟。

接下来，将一个磁性细胞分离柱置于单孔或四孔细胞分离磁铁上。在每个分离柱下方放置一个开口的15毫升锥形管，用于收集流穿液。用3毫升冷的分选缓冲液预处理分离柱，使缓冲液依靠重力自然流过柱体进入下方的锥形管。

细胞与微珠孵育10分钟后，加入冷分选缓冲液至1毫升体积，并将混合液通过置于柱子上方的100微米细胞筛网过滤。将柱子的流出液收集到柱子下方放置的新的15毫升锥形管中。待细胞悬液完全流尽后，向原始试管中再加入3毫升冷分选缓冲液，并通过筛网将其加至柱子中，然后移除筛网。

当样品完全流穿进入柱子且无液体继续流出时，将柱子从磁铁上取下，并置于新的15毫升锥形管上。向柱子中加入5毫升冷分选缓冲液。为洗脱结合的细胞，将柱塞连续向下推动一次，使缓冲液从底部压出至新管中。

将洗脱的样品在4°C下以400 × g离心五分钟。小心吸去上清液，保留约100微升上清液以及细胞沉淀。平均而言，富集过程可从肺组织中回收超过99%的CD90.2+ T细胞，纯度超过90%。

在对肺组织样本进行T细胞富集后，向每个样本中加入1毫升10毫摩尔的达沙替尼。涡旋混匀后，在室温下孵育5分钟。加入PE或APC标记的肽-MHC四聚体，使其终浓度为10纳摩尔。

涡旋混合后，将混合物在室温下避光孵育一小时。在样本用肽-MHC 四聚体染色的同时，配制用于染色细胞表面标志物的抗体主混合液。在四聚体染色孵育期还剩15分钟时，按1:100的稀释比例加入表面抗体主混合液。

加入 50,000 个流式细胞术计数微球及冷分选缓冲液，使终体积约为五毫升。然后加入冷分选缓冲液至 15 毫升体积，并在 4 摄氏度下以 400 × g 离心五分钟。小心吸除上清液，保留约 100 微升上清液及细胞沉淀。

现在用额外的 200 微升分选缓冲液重悬样本，并将其转移至一个 5 毫升 FACS 管中。