慢病毒生产

该实验步骤首先用慢病毒、质粒及病毒包装载体转导293T细胞，病毒上清液在至少48小时的孵育后收集。将上清液过滤后，通过超速离心进行浓缩。病毒沉淀用PBS重悬以测定病毒滴度，首先将浓缩的病毒加入完全培养基中稀释，然后进行系列稀释，以用慢病毒感染细胞。

大家好，我是来自加利福尼亚大学旧金山分校糖尿病中心Michael McManus实验室的Shein Wong。我是Michael McManus。今天我们将向您展示一种慢病毒制备的操作流程。

我们在实验室中采用此方法制备用于RNA干扰的慢病毒。现在开始操作。首先，准备用于转染293T细胞的DNA。

首先，在1.5毫升离心管中将FU基因六转染试剂稀释：加入30微升Fuji六与600微升无血清培养基混合。加样时注意避免Fuji接触管壁，加完后于室温孵育5分钟。接着，在管盖内将4微克慢病毒质粒与1.33微克辅助质粒混合。

每种第三代病毒包装载体。慢病毒质粒包含DNA。该病毒会将其插入所感染的每个细胞的基因组中，而包装载体则包含生成慢病毒所需的所有其他蛋白质的基因。盖上管盖，通过轻轻颠倒试管数次进行混匀。

将DNA与转染试剂在室温下孵育15至20分钟。现在可以开始用您已准备好的DNA转染293细胞了：使用24小时前接种且在组织培养罩中已达到50%至70%汇合度的细胞，将所有已制备的DNA溶液加入293细胞培养板中，通过轻轻前后倾斜培养板使其混合均匀，然后将细胞放回培养箱，继续培养48至96小时以进行病毒生产，之后再进行收获。在孵育期间，293细胞会产生慢病毒，其基因组中含有您所关注DNA的RNA拷贝。

现在可以收集病毒了。将细胞从培养箱中取出。在生物安全柜中准备好0.4或5微米的注射器滤器、一次性10毫升注射器以及一个UltraClear Beckman离心管。

使用一次性注射器移除上清液，此时上清液中含有病毒。在注射器前端安装一个0.45微米的注射式滤器，将病毒过滤至一个UltraClear Beckman离心管中。该滤器仅允许病毒通过，而阻止细胞通过。过滤后，将所有产毒细胞弃置并进行孵育。

将培养皿、注射器和滤器置于含10%次氯酸钠的溶液中浸泡45分钟。现在您已收集并过滤了病毒，接下来需首先通过超速离心来浓缩病毒。使用无血清DMEM将所有含病毒的离心管配平，使其重量相差不超过0.2克。

接下来，将平衡好的离心管装入 SW 41 TI 或 SW 28 转子吊桶中。密封转子吊桶并将其挂到转子上，然后将转子放入超速离心机中。

将病毒在4°C条件下，使用SW 41 TI转子以25,000 RPM离心约90分钟，或使用SW 28转子以24,000 RPM离心。离心结束后，返回组织培养操作台，将离心管倒置，将上清液倒入含有10%次氯酸钠的容器中。用Kim擦拭纸吸除沉淀周围多余的液体，并将离心管倒置放在合适的架子上，静置不超过5分钟，待准备重悬沉淀时即可进行下一步操作。

用滤芯吸头向离心管中加入 100 µL 无菌预过滤的 PBS，以重悬病毒沉淀。然后上下吹打约 20 次。将病毒于 4°C 下静置过夜，以完成重悬。

病毒制备物可在4摄氏度下保存约一周，在零下80摄氏度下可保存长达一年。丢弃所有空管前，请务必用10%漂白剂处理。如果计划使用病毒制备物超过一周时间，可将其保存在冰箱中。

为后续实验准备5至20微升的最小分装 aliquot，另准备3至5微升的 aliquot 用于滴定，冻存于约-80℃。下一步是测定病毒滴度。如果您的慢病毒质粒中包含荧光报告基因，则感染的细胞将发出荧光，您可使用流式细胞术测定病毒滴度。

首先，将三微升浓缩病毒加入到6个孔（1至6号孔）中，每孔含有1.5毫升完全培养基，置于96孔板的一行内。向所有6个孔中加入100微升完全DM培养基进行系列稀释。向第一个孔中加入100微升不含病毒的培养基。

这是未染色的对照组。向第二孔中加入100微升稀释后的病毒至第三孔。将第二孔中混合液的100微升加入到第四孔中。

将从第三孔中加入100微升至第五孔。将从第四孔中加入100微升至第六孔。将从第五孔中加入100微升。

最后从第六孔中取出100微升液体弃去，并用DMEM将所有孔中的终体积补至200微升。每次稀释后，病毒浓度减半。请注意，此处提供的仅为建议稀释比例，适用于滴定大多数高浓度病毒。

如果病毒滴度较低或未浓缩，则可能需要调整稀释比例。废弃稀释后未使用的病毒液前，需先用10%次氯酸钠处理45分钟，再弃入生物危害废物容器中。向六孔板的每个孔中加入约15,000个健康且处于活跃分裂状态的293T细胞。

可以使用一块96孔板对16种病毒制备物进行滴定，将每孔补液至200 µL，将细胞放回培养箱中，使感染持续至少48小时。孵育结束后，使用流式细胞仪分析细胞荧光。可通过每孔中荧光细胞的百分比来确定滴度，即每毫升病毒加入液中具有感染性的病毒颗粒数量。

在分析流式细胞仪结果时，使用以下公式计算每毫升的感染单位数。请注意，只有当每个细胞感染的病毒整合事件不超过一次时，才能获得准确的滴度计算结果。

为确保符合此条件，应使用感染率低于15%的细胞进行计算。感染率较高的细胞可能已接受多个病毒整合拷贝。步骤二中建议的稀释方法应能获得多个处于该感染率范围内的样本。

理想情况下，应使用多个样本生成滴定曲线，并据此计算最终滴度。可通过拟合的线性曲线所得公式计算病毒滴度，但在必要时也可使用单个样本进行计算。对于未浓缩的病毒，预期滴度约为每毫升1×10⁷转导单位；对于浓缩后的病毒，预期滴度约为每毫升1×10⁸转导单位。

我们刚刚向您展示了在此操作过程中如何制备慢病毒。遵守所有生物安全规定并妥善处理废弃物非常重要。就这些。

感谢观看，祝您的实验顺利。