包装基于HIV或FIV的慢病毒载体表达构建体及VSV-G假型病毒颗粒的转导

本实验的总体目标是了解慢病毒包装。该实验为期五天。第一天，将293TN生产细胞以计算好的密度接种。

第二天，用含有目的基因的慢病毒载体构建体和病毒包装质粒混合物转染细胞。第四天，加入 PEG 病毒沉淀液收集并浓缩病毒。该实验的最后步骤是收集经 PEG 浓缩的病毒，将病毒分装，并用浓缩后的病毒感染细胞以进行病毒滴度测定。

最终，通过定量PCR检测稳定整合的基因，以计算稳定整合的载体数量。与现有的质粒转染或逆转录病毒转导等方法相比，该技术的主要优势在于，FBI优化的慢病毒包装方案可产生高滴度且具有功能活性的病毒，从而能够高效地将基因递送至几乎所有哺乳动物细胞中，包括难以转染的细胞，如干细胞和不分裂的原代细胞。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为他们不熟悉方案中一些细微但对成功制备高滴度病毒至关重要的操作细节。

该方法的可视化演示非常有用，因为转染过程中通过显微镜观察到的细胞密度决定了病毒包装的效率，进而影响最终的病毒滴度。在适用的情况下，荧光报告基因的表达情况可用于判断转染效率，而转染效率对最终病毒滴度具有显著影响。此外，该方法的可视化演示有助于研究人员熟悉实验方案中一些细微但重要的操作环节，例如在整个过程中维持无菌状态的最佳操作规范，以及如何避免在收获的病毒中混入细胞碎片。

高效的慢病毒包装依赖于三个组分。首先，慢病毒表达载体必须包含病毒包装和稳定整合所需的部分元件，以及目的基因表达所需的元件，如短发夹RNA、microRNA或报告基因表达盒。

其次，慢病毒包装质粒必须提供将表达载体的RNA拷贝包装成重组假病毒颗粒所必需的蛋白质，以及在感染后进行逆转录和病毒整合所需的蛋白质。第三，293TN生产细胞必须与表达载体和包装载体进行瞬时共转染。这些细胞可产生高滴度的假病毒颗粒，可从培养基中收集。

最终，靶细胞转导的成功与否主要取决于特定细胞类型中每个细胞所接触的病毒颗粒数量。换句话说，感染复数的确定始于培养293TN细胞。在15厘米的细胞培养皿中培养18至24小时，以达到60%至80%的融合度。

转染时，每块培养板可获得约1400万个细胞，以提高病毒产量。当次日293TN细胞融合度达到60%至80%时，即可进行转染，此时可使用多块培养板。对于每块细胞培养板，向一个15毫升Falcon管中加入1.6毫升无血清DMEM培养基。

然后，将22.5 µg的ppac H one或Ppac F1以及4.5 µg的慢病毒载体构建体加入DMEM中，通过吹打混匀。接着，向同一离心管中加入55 µL的纯化转染试剂，涡旋振荡10秒，随后在室温下孵育15分钟。孵育15分钟后，将每管混合物分别加入一个培养板中。

逐滴加入后轻轻摇晃培养板，然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养48小时。如果慢病毒载体构建体表达荧光基因（如GFP），可在显微镜下观察细胞，成功的转染将使50%至90%以上的细胞呈现绿色荧光。此时收集细胞培养上清液至50毫升锥形管中。上清液中含有具有感染性的假病毒颗粒。

从培养板上脱落的任何细胞都不会对病毒的产生造成负面影响。为去除杂质，将病毒上清液在室温下以1500 ×g离心15分钟。然后，在不扰动沉淀的前提下，收集病毒上清液，注意留下约500微升的上清液作为缓冲层，并进入下一步操作，即在转染后72小时浓缩病毒颗粒。

在收集病毒原液后，可使用相同技术对病毒上清液进行第二次可选收集。在50毫升聚丙烯离心管中，向每四体积上清液加入一体积预冷的PEG病毒沉淀液进行浓缩。颠倒混匀溶液。

切勿使用涡旋振荡器，然后将溶液在4°C下静置保存，最长可保存96小时。冷藏至少12小时后，在4°C下以1500 ×g离心30分钟。离心后，聚乙二醇沉淀的慢病毒颗粒将在管底形成淡黄色或白色沉淀。

现在，小心吸除所有液体，注意不要扰动沉淀中的慢病毒颗粒。或者，去除大部分上清液，将沉淀重悬于剩余的上清液中。然后将悬液转移至一支无菌的2毫升离心管中，在低温微量离心机中离心2分钟。

在14,000 RPM转速下，用移液器吸除剩余的上清液，并将慢病毒颗粒沉淀物重悬于预冷的无菌缓冲液中，缓冲液体积为原体积的十分之一至百分之一。小心地将沉淀物用移液器吹打溶解，避免产生气泡，并始终保持样品处于低温状态。确保沉淀物完全重悬。

最后，将墨水在冰上分装至无菌冻存管中，每管体积为15至25微升，并将冻存管置于负70摄氏度保存。一次成功的包装实验每毫升可获得1000万至10亿个IFU，用于24孔细胞培养板的病毒感染实验，每孔接种50,000个细胞，在指定的培养条件下过夜培养。用于滴定目的时，细胞融合度应达到50%至70%。

HT 10 80 细胞可作为易于转导的对照细胞系，次日吸弃细胞中的培养基。然后将培养基与浓缩的转导溶液混合，使转导颗粒的终浓度为 1×，取 0.5 毫升转导液加入至含靶细胞的各孔中，靶细胞密度应为 50% 至 70% 汇合度，在各孔中按以下稀释比例加入病毒：1:100、1:10 和 1:1 的原液稀释。

病毒可与靶细胞保持接触长达72小时而不更换培养基。72小时后，前病毒将稳定整合至宿主基因组中，并表达目的基因。若存在荧光标记，可通过不同病毒稀释度下的荧光表达情况来评估转导效率，随后可通过QPCR定量感染单位数量。

一旦确定病毒滴度，即可计算出为其他靶细胞达到预期感染复数所需的适当病毒体积。测定滴度并控制感染复数（MOI）可确保不同实验及不同病毒制备物之间的一致性。该病毒现已可用于进一步的实验。

转染当天，293TN 细胞的起始密度对病毒包装的成功至关重要。这些 293TN 细胞的融合度介于 60% 至 80% 之间。成功转染表达 GFP 的慢病毒载体 24 小时后，发现至少 90% 的 293TN 细胞呈现绿色荧光。

转导后72小时，GFP在HT 1080宿主细胞中持续表达。这表明慢病毒载体已稳定整合至宿主基因组中。以10倍稀释比例转导相同的宿主细胞，GFP表达量相应减少。因为病毒滴度与慢病毒介导的基因表达呈正比关系。

一旦掌握，该技术可在五天内完成，每天大约需要一到两个小时，前提是操作得当。观看本视频后，您应能充分理解如何高效、安全地包装具有功能活性的病毒感染颗粒，并成功将细胞转导该病毒。请务必注意，慢病毒操作可能存在危险性，应采取相应预防措施，例如在生物安全二级（BSL-2）细胞培养生物安全柜中进行操作。

进行此操作时，应始终穿戴实验服和手套。