利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

该技术中，使用惰性与生物素化聚乙二醇分子的混合物对玻璃盖玻片进行功能化处理。利用该功能化表面构建流动池，并将其置于全内反射显微镜上。通过多价链霉亲和素将生物素标记的滚环扩增模板固定在表面。

当通过添加复制区蛋白和核苷酸对底物进行复制时，所生成的双链DNA在层流作用下延伸，并利用一种嵌入式染料实时成像。大家好，我是来自哈佛医学院生物化学与分子药理学系Antoine Van Oijen实验室的Nathan Tanner。我是同样来自Van Oijen实验室的Joe Laro。

今天，我们将向您展示一种在单分子水平上实时进行DNA复制荧光成像的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究单个复制复合物的协同DNA合成活性。现在，让我们开始吧。

开始此实验步骤时，将生物素标记的尾部寡核苷酸与M13单链DNA退火：在TBS缓冲液中加入10倍过量的寡核苷酸，加热至65摄氏度，随后关闭加热模块，使其缓慢冷却，以确保引物正确退火。现在引物M13已准备就绪，将其加入含有64纳摩尔T7 DNA聚合酶、T7复制缓冲液、dNTPs和氯化镁的混合物中，在37摄氏度孵育12分钟。孵育结束后，用100毫摩尔EDTA终止反应。

接下来，使用苯酚-异戊醇-氯仿对补平后的产物DNA进行纯化，通过抽提并透析至TE缓冲液或其他合适的储存缓冲液中。每次有机相需反向提取，以回收任何残留的引物。透析后，使用紫外-可见分光光度计测定M13 DNA的浓度。一次模板制备可获得足够浓度的纳米摩尔级模板，用于数百至数千次单分子实验。

现在DNA已准备就绪，接下来开始制备功能化盖玻片。待扩增的DNA将连接到经阿米胺（Amil Lane）功能化的玻璃盖玻片上，阿米胺的Oxy基团与玻璃结合，留下一个可与生物素化聚乙二醇（peg）分子结合的氨基。该涂层有助于减少非特异性结合到表面。

为了彻底清洁玻璃盖玻片，将其放入染色缸中，并用乙醇超声清洗液充满染色缸。超声清洗30分钟后，倒掉乙醇并用1摩尔的氢氧化钾超声清洗液充满染色缸，继续超声清洗30分钟，并重复上述两种清洗步骤各一次。在进行第一次功能化反应前，必须去除所有残留的水分。

将染色缸中装入丙酮，超声处理10分钟。倒空染色缸后，再次加入丙酮。随后向染色缸中加入西奈试剂，振荡反应2分钟。

然后加入大量过量的水进行淬灭。接着将盖玻片置于烘箱中，在110摄氏度下烘烤30分钟以干燥。随后，通过加入末端胺化的PEG制备浓度约为0.2%（重量/体积）的PEG混合液，将玻璃盖玻片作为间隔物以实现盖玻片之间的分离，用移液器吸取100微升该混合液滴加到一片干燥的硅烷化盖玻片上。

在上方放置第二块盖玻片。将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时。然后将每对盖玻片分开，并用大量水充分洗涤。

注意保持盖玻片的功能化面朝上，因为只有一侧涂有聚乙二醇（peg）。最后用压缩空气吹干盖玻片，并将其置于干燥器中的真空环境下保存，表面至少一个月内保持稳定。因此可一次性制备数十个盖玻片，按需使用。

现在盖玻片已准备就绪，可以组装单分子实验所需的流动池。首先，将 20 至 25 毫升含有 BSA 的封闭缓冲液置于干燥器中，以去除后续步骤中可能存在的气泡。接下来，将 25 微升链霉亲和素稀释于 100 微升 PBS 中，并将该溶液均匀涂布于经 peg 修饰的功能化盖玻片表面，在室温下孵育 20 分钟，使链霉亲和素与表面的生物素结合，同时可准备流动池的其他组件。

在盖玻片孵育的同时，裁剪一段双面胶带（两面均有背衬），使其尺寸与用于组装流动室的石英载玻片相匹配。用铅笔在胶带上标记出管路孔的位置，以便在胶带上绘制流动室的轮廓。标记完孔位后，在标记周围制作一个2毫米宽的矩形框。

该矩形将作为流体通道，因此务必确保侧边平直，并在管路进出口周围预留足够空间。现在沿着绘制的轮廓线裁剪已标记的胶带，进行平直且干净的切割，以确保没有胶粘剂突入通道内。使用丙酮彻底清洁石英载片，以去除之前实验中流动池构建所残留的胶粘剂。

找到通道轮廓的最佳对齐位置。移除胶带背衬的一侧，小心地将胶带贴到载玻片上。注意正确对齐胶带，确保进样口和出样口的孔洞不被堵塞。

接下来，准备长度合适的0.76毫米内径管，用于流式池的进液口和出液口。将管子末端以约30度角斜切，有助于防止管子末端紧贴腔室底部。将管子悬挂在试管架上，以便在后续步骤中方便地连接到流式池。

此时盖玻片孵育已结束。用清水彻底冲洗链霉亲和素包被的盖玻片，并用压缩空气吹干。注意不要将盖玻片翻转，因为仅一侧具有功能化表面。

最后，通过移除胶带另一侧的背衬，并将石英载玻片放置在盖玻片上，完成流动室的组装。轻轻按压盖玻片，以排出粘合剂中夹带的任何空气。这有助于防止气泡进入流动通道。

用环氧树脂密封腔室的侧面。将切割好的管子插入石英片的孔中，并用环氧树脂固定，静置几分钟使其干燥。环氧树脂密封干燥后，开始进行表面封闭。

使用21号针头，从其中一根管中吸取部分脱气封闭缓冲液。反复冲洗数次以去除气泡，并让反应室孵育至少半小时，然后再进行单分子复制实验。

封闭流式池后，将其放置在显微镜载物台上。使用载物台夹固定样品池，并确保流道沿 y 轴方向对齐。使用直径较大的连接管将流式池的出口管与注射泵相连。

将进样管放入封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的任何空气。轻轻弹击出样管，有助于清除流动池中滞留的气泡。现在加入DNA，将储备DNA模板用1毫升封闭缓冲液稀释至25皮摩尔，以中等流速（例如0.025毫升/分钟）流入反应室，持续30分钟，以实现DNA在表面的良好覆盖。

DNA进入反应室后，使用封闭缓冲液清洗至少200个流通池体积，以去除多余的DNA。为彻底清除游离的DNA，开启激光器和相机。冷却式CCD需达到设定温度后方可使用。

洗去多余的 DNA 并对复制缓冲液进行脱气后，在复制缓冲液中配制包含核苷酸、DTT 和细胞毒素的复制反应混合物。然后加入蛋白质，轻轻混匀。接着将反应混合物注入流动池中。

此处的流速需要足够大，以拉伸双链 DNA，适用于宽度为 2 毫米、高度为 100 微米的流动通道，0.04 毫升/分钟的流速效果良好。让混合物进入腔室约需 10 分钟时间。

将视野移至通道的一侧，并聚焦于粘附材料，以确保接近表面进行聚焦并开始成像。调节激光功率、显微镜焦距和扫描角度。保持较低的激光功率，以避免染色DNA发生光裂解。

根据DNA复制速率，以每秒一到五帧的速度采集几分钟的图像。若需获得更长的复制轨迹，可重复实验；当几乎所有反应混合物已被泵入细胞时，更换视野以观察更多分子，通过加入含细胞色素c的缓冲液冲洗流动池，从而观察其他视野。对不同复制分子进行多次成像，可为确定复制效率提供统计学数据。

在滚环扩增中，复制实验的前导链合成延伸了连接环状模板与表面的尾部，随后由滞后链聚合酶将尾部转化为双链DNA，并通过层流拉伸。以下是使用532纳米激发光的Cy3橙色荧光成像视野示例。

微小的荧光点为固定的未复制底物。注意产物的极长长度以及每个视野中大量的产物数量。典型的视野中可见多个正在复制的分子，表现为逐渐增长的明亮DNA染色条带。在37摄氏度下进行的大肠杆菌实验中，每个视野中的分子数量为5至50个，具体数目取决于表面密度。

T7复制区域的起始效率要高得多，可在视野中复制超过50%的分子。由于密度如此之高，很难分辨出单个分子，如图中所示。因此，应在较低的蛋白质浓度或表面密度下进行T7实验。来自大肠杆菌和T7实验的典型复制分子的Chime图包含大肠杆菌和T7分子的终点轨迹，轨迹随时间变化绘制。通过线性回归拟合轨迹以获得复制速率，在本例中，大肠杆菌为每秒467.1个碱基对，T7为每秒99.4个碱基对。

对于T7，单个分子轨迹的速率分布通过单高斯拟合，得到大肠杆菌（e coli）的平均速率为535.5 ± 39 碱基对每秒，G7的平均速率为75.9 ± 4.8 碱基对每秒。对于T7，复制产物的长度分布通过单指数衰减拟合以获得持续合成能力，该值在大肠杆菌中为85.3 ± 6.1 千碱基对，在G7中为25.3 ± 1.7 千碱基对。接下来，我们刚刚向您展示了如何利用单分子方法测量协调的DNA复制过程。

进行此操作时，需注意正确地对盖玻片进行功能化处理，并制作出干净、笔直的流道。务必控制激光功率负荷，尽量减少长链 DNA 的光解作用。以上即是全部要点。

感谢观看，祝您的实验顺利。