利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

本实验的总体目标是直接观察并定量活体细菌细胞中DNA结合蛋白的活性。该目标通过观察表达光激活荧光蛋白与目标DNA结合蛋白融合体的细胞来实现。实验的第二步是在成像过程中获取单个蛋白被光激活的动态影像。

然后通过分析数据来确定蛋白质的定位，并在单个细胞内追踪蛋白质的运动。当单个蛋白质与染色体接触时，其扩散系数发生变化，由此可识别DNA结合事件。最终，通过统计每个细胞中结合态和扩散态蛋白质的数量，该方法可提供单细胞水平上蛋白质与DNA相互作用的定量测量结果。

该方法有助于回答DNA修复领域中的关键问题，例如体内修复速率以及修复位点的空间分布。接下来，我们将通过测量DNA聚合酶I在活的大肠杆菌细胞中的修复活性来演示该方法。首先，在500摄氏度的炉中加热盖玻片一小时，以去除背景荧光颗粒。使用厚度为1.5号的盖玻片进行灼烧处理，之后将其用铝箔包裹，于室温下保存。

它们在接下来的数周内均保持良好状态。接下来，取1毫升处于对数生长期的AB 1157菌株大肠杆菌（E coli），置于1.5毫升的微量离心管中，该菌株含有poly a PA m cherry质粒，以2,300 ×g离心5分钟。

移除上清液，将细胞沉淀重悬于20 µL残留培养基中，并涡旋振荡使细胞充分分散。接着，用蒸馏水配制1.5%低荧光琼脂糖溶液。对于使用甲基磺酸甲酯（MMS）进行的DNA损伤实验，需谨慎操作，将500 µL熔化的琼脂糖与500 µL 2×最低培养基轻轻吹打数次，充分混匀。

在混合 aros 之前，将 8.3 µL MMS 加入 500 µL 最小培养基中，确保在混合物冷却前完成混合。将混合物涂布在灼烧过的盖玻片上，均匀且居中铺开，避免产生气泡。

用第二片灼烧过的盖玻片压平琼脂垫。待冷却后，移除琼脂垫上方的盖玻片，加入一微升浓缩的细胞悬液。用一片新的灼烧盖玻片覆盖琼脂垫，并轻轻按压，以固定细胞。

应在细胞干燥前45分钟内进行成像。为了延长成像时间，可在进行DNA损伤实验时将载片密封在硅胶垫圈内。成像前，将细胞在载片上孵育20分钟。

在室温下的加湿容器中，显微镜配备有405纳米的光激活激光器和561纳米的激发激光器。通过使用高倾斜照明仅激发盖玻片表面薄层内的荧光分子，实现单分子灵敏度，荧光发射信号被记录在电子倍增CCD相机上。将样品置于显微镜载物台上，并调节至细胞清晰对焦。

在透射光照明下，定义一个裁剪后的视野范围，以减小数据量并提高相机读出速度。用遮光材料覆盖样品以隔绝环境光，并开启电子倍增CCD相机增益，用于单荧光四通道检测。将帧率设置为每帧15.26毫秒。

这包括 0.26 毫秒的相机读出时间。曝光时间需要足够短，以观察到清晰的荧光点，且运动模糊尽可能小。另一方面，需要以足够长的时间间隔采样轨迹，以明确区分结合态分子与扩散态分子。现在显示相机数据，以检查暗背景信号。

打开561纳米激光器并检查激发背景信号。打开405纳米激光器以光激活Paul one PA M cherry融合蛋白，并逐步增加激光强度，直至出现单分子的荧光点。现在调节激发光束的角度，使仅照射样品的薄层区域。

闭合盖玻片表面。该方法依赖于对单个荧光蛋白的检测和精确定位，因此显微镜的最佳对准和灵敏度对数据质量至关重要。为此，需将激光束聚焦至100倍数值孔径1.4物镜的后焦平面。

将聚焦透镜沿垂直于光束的方向平移，会使焦点偏离物镜中心，导致光束以一定角度从物镜射出。调整时应使荧光强度最大化，同时使背景信号最小化。在透射光显微镜模式下找到一个新的细胞视野，并对图像进行聚焦。

拍摄相机快照以记录细胞轮廓。打开561纳米激光器，漂白盖玻片上的细胞自发荧光和背景斑点。持续数秒。

开始数据采集之前，在561纳米连续激发条件下启动掌状结构成像视频的采集。打开405纳米激光器，并在视频采集过程中逐渐增加其强度，最高达到1瓦特每平方厘米。应避免使用过高的405纳米激光强度，以免引发细胞自发荧光。

请注意荧光分子的密度。保持较低的激活率至关重要，以确保每帧图像中的荧光点清晰分离。每段视频记录约10,000帧，在视野裁剪的情况下，通常需要长达三分钟，并占用高达一吉字节的硬盘空间。

请注意，一旦某个视野被成像后，pa m cherry 荧光分子将发生不可逆的漂白，无法再被观察。同样，以下步骤使用了基于 MATLAB 的自定义软件。单个荧光分子表现为点扩散函数（point spread functions, psfs）。

在影片中，首先使用直径为七个像素的高斯核对带通滤波图像进行处理，以识别点扩散函数（psf）。候选位置对应于峰值像素强度高于背景标准差4.5倍的PSF。每个候选PSF所在区域中最亮的像素点作为拟合椭圆高斯函数的初始估计值。自由拟合参数包括X位置、Y位置、X宽度、Y宽度、旋转角度、振幅以及背景偏移量。

椭圆高斯掩模用于考虑曝光时间内分子的移动，这种移动会使点扩散函数（PSF）图像模糊并发生形变。将PALM视频所有帧中得到的XY定位结果叠加到同一视野的透射光显微图像上，Paul one PAM Cherry的定位应出现在大肠杆菌细胞的中央区域。自动追踪可测量蛋白质的运动，但追踪窗口的成功选择至关重要。

首先，针对一系列跟踪窗口参数运行跟踪算法。绘制每个细胞中测得的轨迹数量随跟踪窗口变化的曲线，以确定不会导致轨迹断裂的最小跟踪窗口，并将得到的轨迹叠加显示在相同视野的透射光显微图像上。为了可视化分子在细胞内的空间运动分布，P one 轨迹应显示分子扩散被限制在单个细胞内。如果部分轨迹似乎在细胞之间跨越，则表明由于跟踪窗口选择过大和/或光激活速率过高，导致不同分子被错误地连接。

绘制连续定位之间步长的累积分布。当跟踪时间窗口足够大时，曲线会平滑上升并趋于饱和；若时间窗口选择过小，则会出现截断边缘。选定合适的时间窗口后，即可分析Paul one的扩散特性。

仅使用包含至少五个定位点的轨迹，以减少均方位移（MSD）的统计不确定性，针对每条具有 n 步的轨迹，计算连续定位点之间的均方位移（MSD）。接下来，根据 MSD 计算每条轨迹的表观扩散系数。第二项用于校正估计的定位误差。

这些是第二项的数值。在此示例中，现在绘制视野中所有轨迹测得的扩散系数值的直方图，分别针对未受损细胞中的 pol one 以及经 MMS 诱导 DNA 损伤处理的细胞中的 pol one。红色柱状图代表与染色体结合且扩散速度低于 0.15 平方微米每秒的单个 pol one 分子群体，而自由扩散的分子扩散速度约为 0.9 平方微米每秒。

在确定结合的Pol I分子后，可以在未受损细胞以及具有mm MS损伤的细胞中可视化结合位点的位置。结合轨迹数占观察到的总轨迹数的比例，可直接定量反映Pol的DNA修复活性。

在活的大肠杆菌细胞中进行了体内光激活实验，以激活Pol I与PA-mCherry融合蛋白。光激活可局限于单个细胞中的单个PA-mCherry荧光蛋白，而较高的光激活率则显示出更多的荧光分子。对PALM成像序列的每一帧均进行了定位分析。

通过固定细胞中的静止分子或活细胞中的结合分子测量了定位精度，结果为40纳米，与理论预测一致。接下来，当定位阈值设置过低时，背景噪声中的随机峰会被错误地选为候选位置；而当阈值过高时，部分信号点则会被遗漏。

产生的Paul one定位占据细胞的中央区域，大体上重现了大肠杆菌拟核的空间组织结构。在未受损细胞中，大多数Paul one轨迹表现出扩散行为。一个典型的细胞包含数百个Paul one轨迹，这与每个大肠杆菌细胞中约400个Paul one分子的拷贝数一致。

通过计算不同延迟时间下的均方位移（MSD）值，可以识别多种类型的分子运动：定向运动呈现抛物线形曲线，布朗运动表现为一条直线，受限扩散曲线则趋于一个平台值，而固定不动粒子的MSD曲线偏移量反映了其定位的不确定性。

Paul one 的最终 MSD 曲线在短滞后时间内呈线性上升，表明存在布朗运动，而在长滞后时间时由于细胞限制而趋于饱和。利用这些方法，测量了在未受损细胞中，Paul one 对外源性 DNA 烷基化损伤的 DNA 修复活性。Paul one 的扩散系数直方图显示出一个以扩散分子为主的主峰群体。

在持续暴露于100毫摩尔MMS损伤条件下，少量结合的分子可能参与了DNA复制以及内源性DNA损伤的修复。扩散系数接近零的轨迹频率显著增加。这支持了以下模型：在存在诱变剂的情况下，更多的Paul one分子必须参与DNA修复过程。

为了量化蛋白质在细胞内的空间分布，并研究参与DNA修复的较大蛋白质复合物的存在情况，可以进行定位、聚类等其他数据分析方法。