可穿透细胞的蛋白质的构建

在过去的15年中，细胞功能的调控可通过经典的DNA转染或病毒转导方法实现。另一种方法也随之发展：通过将目的蛋白与促进细胞摄取的小肽融合，可将具有生物活性的蛋白质直接递送至哺乳动物细胞内。

由于未使用DNA，避免了过度表达导致的发育缺陷风险。与上述经典方法不同，蛋白质转导能够以可滴定的方式递送蛋白质。

此外，小规模的细胞群体以及非分裂细胞（如有丝分裂后的神经元）也可被调控。为了高效表达重组蛋白，我们推荐使用 Paciz 载体系统。该系统是一种模块化载体系统，包含末端和 C 末端两种变体。

这两种载体均可方便地插入目的基因，用于纯化。载体中整合了组氨酸标签以及蛋白转导结构域。在本例中，利用HI病毒的蛋白转导结构域促进细胞摄取，实现细胞内分布。

核定位信号完成了载体的构建，出于对照目的，融合标签可被简单移除。此外，这些标签的排列方式可能对融合蛋白的性质产生重大影响。其对产量、纯度以及可销售性和生物学功能的影响均不可预测。

您好，我叫 Bernard Mus，我在德国波恩的重建神经生物学研究所干细胞工程组工作。您好，我叫 Christoph P，我也是胡佛实验室的成员。我们课题组广泛采用蛋白质转导技术，将具有生物活性的蛋白质直接递送至多种哺乳动物细胞中。今天，我们将为您详细介绍在大肠杆菌中进行蛋白质表达与纯化的过程。

接下来，我们将向您展示如何在细胞培养中应用细胞永久融合蛋白，以示范整个流程，包括表达、纯化和应用。我们利用位点特异性重组酶 Cre 对小鼠胚胎干细胞进行遗传修饰。好的，让我们开始吧。

为了接种过夜培养物，我们使用保存在–80摄氏度甘油 stock 中的已转化细菌。这些细菌已含有编码decre重组的载体。使用移液器吸头，用吸头刮取少量细菌，并将其放入含有过夜培养物的烧杯中。

过夜培养的培养基为添加了葡萄糖（终浓度为0.5%）和每毫升50微克碳酸胰岛素的LB培养基。随后将烧杯置于37摄氏度的培养箱中，以诱导位点特异性重组酶Cree的表达。我们使用预处理的TB培养基进行大规模表达培养。

为了加快表达速度，我们建议使用预热至37摄氏度的TB培养基，该温度是重组蛋白表达过程中的培养温度。接下来，将葡萄糖加入TB培养基中，使其终浓度为0.5%。葡萄糖可防止在诱导前的表达菌培养生长过程中融合蛋白的基础表达升高。最后，向表达培养物中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100 µg/mL，以确保培养物为纯培养，仅含有仍携带编码目标蛋白的质粒的细菌。

现在我们可以取过夜培养物，并以1:50的比例接种表达培养物。然后将烧瓶转移至37摄氏度的培养箱中进行培养。在整个表达过程中，应定期取样，以测定光密度。

当培养物达到1.5的光密度时，加入IPTG至终浓度为0.5毫摩尔，对细菌进行诱导。诱导一小时后，将表达培养物转移至离心管中，并通过离心收集菌体。本实验使用SLA 3000转子进行此步骤。

离心机以每分钟 5,000 转的速度在 4 °C 下离心 10 分钟。随后弃去上清液，细菌沉淀可在 -20 °C 长期保存。将冷冻的沉淀物重悬于 lizza 缓冲液中，其量相当于一升表达培养物的量。

加入10 ml的lizza缓冲液，等待约15分钟，直至溶液变得均匀。每1 ml悬浮液中加入1毫克溶菌酶。将溶液混合20分钟，使酶能够裂解细菌。

随后，加入Benson Nase，稀释比例为1:1000，继续孵育15分钟，以切割DNA，从而得到非黏稠的溶液。最后，使用超声仪确保细胞完全裂解。在完成认证后，程序以45%的功率运行一个半小时。

请务必在此处的每一步都留样，包括粗裂解液或纯化过程中的SDS-PAGE分析。现在每毫升悬液中加入1 ml预冷的TSB缓冲液至关重要，因为目的蛋白容易在甘油保存液中发生沉淀。如果跳过此步骤，溶液需短暂混匀，此时粗提物即可用于离心。

为此，我们使用 SS 34 转子。离心机在 4°C 条件下以 17,000 RPM 转速运行 30 分钟。离心结束后，小心地将上清液转移至新的 50 ml Falcon 管中。

现在将镍-抗A悬浊液加入上清液中的镍中。抗A是正确纯化组氨酸标签融合蛋白的关键试剂。组氨酸可与镍离子形成复合物，从而实现亲和纯化。现在将离心管在40°C下轻轻振荡60分钟。

一小时后，可将悬液上样至20 mL层析柱，依靠重力流使溶液过柱。对于大规模制备，可将悬液分装至多根层析柱进行操作。随后，用含有15毫摩尔肌醇的缓冲液洗涤层析柱两次。

缓冲液的用量取决于树脂体积。两毫升镍柱NTA相当于一毫升树脂用于洗涤。洗涤后，我们向柱子中加入五倍树脂体积的洗涤缓冲液，现在可以开始洗脱目标蛋白了。

因此，我们使用含有250毫摩尔免疫试剂的洗脱缓冲液。请注意树脂颜色如何逐渐变为绿色。由于CRE蛋白浓度较高，OID组分有时会变得浑浊。

为防止此情况发生，需混匀溶液并加入额外的裂解缓冲液，所有组分现在将被合并，随后转移至透析管中。裂解后，首先进行对含有高浓度盐的缓冲液的透析步骤。一小时后，更换高盐缓冲液，并继续过夜透析。

第二天，将透析袋从高盐缓冲液中取出，转移至甘油缓冲液中。三到五小时后，更换甘油缓冲液，并再次过夜透析。用甘油缓冲液进行透析将得到至少三倍浓缩的储存液。

现在可将储备液在零下20摄氏度保存数年，而不会失去活性。为确保质量，可将收集的SDS-PAGE样品上样至凝胶，随后进行染色。对于Kamasi，Cree融合蛋白在OID组分中表现为一条明显的条带。为了使用适当浓度的Crew重组蛋白，应通过Redford法测定其浓度。

如何将永久性蛋白质导入哺乳动物细胞。首先，准备您的靶细胞，以实现最高的蛋白质转导效率。如果您的靶细胞是成紧凑集落生长的细胞，则应将单层细胞以适当的密度接种，使其在第二天达到80%至90%的汇合度。

提前五小时将细胞分离并进行机械性处理，以获得单细胞悬液。在蛋白质转导之前制备单细胞悬液非常重要，否则只有菌落表面的细胞能够被转导。吸除培养基，并在进行处理前用磷酸盐缓冲液（PPS）短暂洗涤细胞。

去除残留的含血清的完全培养基。用移液管吸去PPS覆盖层中的细胞，静置滴落，然后让细胞孵育3至5分钟。现在在显微镜下检查，确认所有集落是否均已分散为单个细胞。

上述原因表明，这是将蛋白质转导入 yes 细胞的关键步骤。将悬浮细胞转移至离心管中，将离心管放入台式离心机，离心沉淀细胞，吸除上清液，重悬细胞。

在生长培养基中将细胞稀释至适当的细胞数量。当然，这取决于组织培养皿的大小。将细胞在培养皿中孵育，额外孵育五小时。

这将使气室细胞有足够时间贴附到底部并贴壁生长。三类细胞株可在零下20摄氏度保存两年以上。在处理重组细胞永久融合蛋白时，拥有此类可按需使用的储备溶液非常有益。

在等待细胞贴壁至培养皿的同时，可先配制C转导培养基，只需将适量胆固醇储备液中的细胞永久性蠕变蛋白加入培养基中即可。由于Clare储备液尚未经过灭菌，转导培养基在使用前必须进行无菌过滤。我们建议使用可旋接至小叶蛋白结合滤膜的注射器。

最终的感染浓度取决于细胞类型或培养基添加物。例如，血清对转导效率具有强烈的抑制作用。可通过使用无血清培养基或提高感染浓度来克服这一影响。

我们找到了能够实现最高重组效率的最佳条件。将脱氢酶浓度从0.5微摩尔开始逐步增加至10微摩尔。我们建议测试6至18小时之间的不同孵育时间。

孵育5小时后，取出目标细胞并吸除交叉培养基。随后，将其替换为蛋白转导培养基，将细胞放回培养箱中过夜孵育。用PPS短暂清洗D细胞，并将蛋白转导培养基更换为正常的ES培养基。

孵育48小时后，可通过xul检测到细胞中稳定表达的Cree基因。经染色后，具有阳性bega表型的细胞已通过位点特异性重组成功实现基因工程改造。Cree报告。

细胞在预先介导的重组后携带CRE并使用Lae构建体。一个由P片段 flank 的终止序列被切除，同时由team启动子驱动的luxe报告基因被激活。为了评估预处理报告基因空气细胞中的重组效率，细胞必须进行固定。

吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，加入 4% PFA 覆盖细胞，并在室温下孵育 10 分钟。随后再次用 PBS 洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，吸去 PBS，向孔中加入 Xal 染色液，在 37 摄氏度培养箱中孵育过夜。

第二天，可通过观察蓝色环状细胞来监测 Beal 活性。重组效率可通过蓝色菌落数量来确定。在最佳条件下，重组效率应可达到 90% 以上。好了，今天向您展示了如何在大肠杆菌中表达并纯化位点特异性查询重组系统。

在此原理验证研究中，我们能够在大多数盐中诱导出重组。好了，就这些。祝您的实验顺利。I.