基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

该基于纳米结构芯片平台的总体目标是以高度并行的方式在单分子水平上分析膜蛋白功能。通过其解析单个蛋白质的能力，可获得关于膜转运和通量的新见解。该方法有助于回答膜蛋白领域的一些关键问题，例如单个通道或转运蛋白的电导性或转运行为，特别是那些携带非生电性底物的通道或转运蛋白。

该技术的主要优势在于其高并行性，这源于纳米结构芯片的设计，该芯片具有数十万个纳米孔，并能对转运事件进行荧光检测。该技术的应用前景包括为膜蛋白构建高效的筛选文库。因为基于芯片的平台能够实现高度并行且自动化的转运记录。

通常，初次接触该方法的研究人员能够很快掌握所述技术的操作。本研究始终致力于开发一种用户友好的检测方法，以便所有感兴趣的人员均可采用。该膜转运检测利用绝缘体上硅晶圆，通过反应离子刻蚀技术进行加工制备。

每片晶圆可制备约 1,000 个检测芯片。每个芯片包含 250,000 个微腔。这些微腔由含有目标转运蛋白的脂双层密封。

膜构成传感器的界面。最初，荧光材料被限制在脂质双层的一侧，对应于其组成的脂质体内部。每个腔室均可通过多光谱荧光读出进行寻址。

不透明的顶层可阻隔缓冲液储液池中的荧光信号，使该生物芯片与倒置荧光显微镜兼容。通过原子力显微镜测量，二氧化硅层上均匀排列的孔隙开口及其表面粗糙度为3.6纳米，是囊泡融合的最佳尺寸。扫描电子显微镜显示了穿过纳米孔的横截面，可通向硅芯片内部的飞升级微腔。

本视频展示了蛋白脂质体的制备、检测芯片的准备以及基本检测操作的执行过程。将一个经乙醇清洗过的圆底烧瓶连接至旋转蒸发仪。在300毫巴、30摄氏度水浴温度及最大旋转速度条件下干燥脂质膜40分钟，以在烧瓶玻璃壁上形成均匀的脂质膜。

然后，使用高真空泵在室温下将脂质膜进一步干燥30分钟。接着，向烧瓶中加入5毫升缓冲液和8个经乙醇洗涤过的玻璃珠，以制备多层囊泡。将烧瓶连接至旋转蒸发仪，在50摄氏度下以最高速度旋转，不抽真空。

45分钟后，溶液将呈现乳白色，瓶壁上无残留脂质膜。将烧瓶转移至惰性气体环境中，放入超声浴中，在室温下超声处理4分钟。超声处理可破坏脂质体，使其变为单层脂质体。

现在，将大单层囊泡（LUV）溶液分装成每份1毫升，使用液氮和40 °C水浴进行五次冻融循环。这将导致脂质体破裂、重排并生长。在最后一次冷冻步骤后，将所有样品保存在-80 °C条件下。

在重建LUV等分试样之前，使用微型挤出器将脂质体通过400纳米聚碳酸酯滤膜挤出17次。然后通过加入4%Triton X-100使溶液中LUV的浓度达到0.25%，以破坏LUV的稳定性。将混合物在50摄氏度下孵育5分钟。

现在，将一份纯化的修饰型 MscL 与 20 份去垢剂饱和的脂质体混合，继续孵育 30 分钟。孵育结束后，取 100 微升等分试样，加入等体积的 30 毫摩尔钙调磷酸酶。将此混合物在 50 摄氏度下孵育 5 分钟。

现在，从经煅烧处理和未处理的样品中去除去垢剂。向每个样品中加入含Tris缓冲液的湿生物珠，并在4摄氏度下于旋转板上孵育过夜。在实验前，使用活性测定法检测一份制备样品的活性。

首先，将弹性体基质与固化剂混合，并将混合物充分干燥，直至其完全脱气。配制好的粘合剂必须在30分钟内使用完毕。同时，采取适当防护措施，使用5毫升氯仿从玻璃注射器中涂布，清洗盖玻片，然后让玻片自然干燥。

现在，使用10微升移液器将制备好的粘合剂滴加到盖玻片上。然后，用精细镊子小心地从晶圆板上取下一块芯片。将芯片有涂层的一面朝上，放置在粘合剂上，并轻轻按压使其与载玻片充分接触，以均匀分布粘合剂。

避免气泡滞留在下方，或粘合剂溢出到芯片上方。同时，确保组装后的结构能够放入八孔载片架中。现在将组装好的样品置于烘箱中，在65摄氏度下干燥两小时。

随后，在 54 摄氏度下用数次溶剂清洗去除芯片上的保护层。首先将安装好的芯片放入载片架中，然后依次在三种溶剂浴中各孵育 10 分钟。

异丙醇、丙酮和异丙醇。接下来，用超纯水小心且彻底地清洗芯片。最后，在氮气 gentle 气流下干燥芯片以完成整个过程。

现在，准备一个八孔粘性载玻片，并将其倒置放在实验台上。然后，小心地提起盖玻片，将芯片面向孔的位置压到粘性载玻片上。让组装体静置数分钟后，再继续后续操作。

在进行易位实验之前，按照文本方案所述，用Tris缓冲液彻底清洗芯片组件。接着，将浴液更换为含有5毫摩尔氯化钙和1微摩尔Oy647染料的DOPE化Tris缓冲液。然后，向芯片室中加入蛋白脂质体，使其终浓度为1毫克/毫升，并等待1小时。

一小时后，用400微升无钙Tris缓冲液将芯片冲洗四次。然后，向每个孔中加入受控染料，使其浓度达到5微摩尔，并继续进行检测。接下来，将芯片架安装到落射荧光显微镜上，聚焦于纳米孔芯片的边缘，以找到微腔结构。

当微腔处于焦点时，扫描纳米孔阵列以寻找顶壁比例最高的区域。具体细节详见文本方案。脂质体已制备完成，并对其粒径分布和分散性进行了检测。

制备的脂质体大于检测所需的孔径，这是至关重要的。单一分散的脂质体也是理想的。在实验前，通过荧光去猝灭实验检测了脂质体制备过程中修饰的MscL蛋白。

含有活性修饰型MscL的脂质体比例足以进行转位实验。在生物芯片上，观察到荧光标记的溶质通过修饰后的MscL通道发生转位。使用化学调节剂MTSET通过静电排斥作用打开经基因改造的MscL通道。

随后监测了腔内荧光信号的下降过程。该过程具有高度可重复性，外排事件非常一致。所得的外排曲线聚集成两个明显不同的群体，分别对应单通道或多通道的转位事件。

该系统能够通过实时分析追踪最多三种具有独特荧光特性的染料。这有助于精确区分阳性结果、单指数外排事件、复杂动力学过程、脂质侵入以及膜破裂现象。一旦掌握，该技术可按顺序连续执行，主要包括芯片制备、样品制备、成像和分析等步骤，从而使整个实验流程具有模块化特点。