基于微流控流动小室的血小板黏附与聚集流动实验

bio flux 系统是一种自动化仪器和微流控装置，可在受控的切向流条件下进行活细胞检测。该系统采用微孔板微流控技术，将微米级流体细胞装置集成到符合 SBS 标准的微孔板中。BioFlex 可用于开展高通量、低血量的血小板黏附与聚集研究。

加入荧光染料标记的全血至孔中，然后流经通道。在受控的剪切流条件下，获取高分辨率显微镜数据，用于量化药物化合物及其他不同参数存在下的血小板黏附与聚集情况。大家好，我是来自Flexion Biosciences公司研发实验室的Mike Schwartz。

今天我们将向您展示一种在血小板黏附实验中使用微流控流动池的方法。我们在实验室中使用该方案进行多种血管生物学实验。现在让我们开始吧。

在运行流体通道实验之前，必须对BioFlux板的微流控通道进行预处理，使其包被上所需的蛋白质，本实验将使用I型胶原蛋白。BioFlux板的24个实验通道各自连接一个入口孔和一个出口孔，其中入口孔位于通道左侧，用于向通道供液，出口孔位于右侧。将I型胶原蛋白储备液稀释至浓度为200微克/毫升。

在 0.02 摩尔的乙酸中，每个使用的通道需要 20 微升。由于本实验需要 11 个通道，因此配制 200 微升的胶原蛋白包被液。一个通道保持未包被状态，用微量移液器枪头轻轻吹打混匀。

使用微量移液器将20微升包被液加入各自通道中，将液体注入孔的内 punch 处。如图中黄色染料所示，向目标微流控通道进样，包括一个不含胶原蛋白的通道，作为血小板黏附和聚集的阴性对照。在所有相应通道中加入胶原蛋白包被液后，将接口连接至培养板。

如果使用的是 bio flux 1000 接口，可将两个锁扣固定在载物台上。如果使用的是 Bio flux 200 接口，则先用手指拧紧四个螺丝，待全部就位后，再使用扭矩扳手将其完全拧紧。

当扭矩驱动器达到最大值时会发出咔嗒声。在Bio Flux软件的手动模式下，从出口处以每平方厘米2D的流速对目标通道施加灌注。我们将使用显微镜上的低倍物镜找到入口孔，并观察相对的内冲孔被液体填充的过程。

几分钟后，应首先看到一滴微小的液体缓慢填充内冲头，当进样口内冲头充满时，通过软件点击“停止”来终止所有通道的灌注。将微孔板在室温下孵育一小时。在此孵育期间，可在一小时孵育结束前开始准备全血。

血液制备完成后，移除界面，并向出口端加入一毫升含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）。从出口端开始灌注，灌注流速为每平方厘米每分钟两滴，持续灌注10分钟。10分钟后，停止灌注。移除界面后，将入口端和出口端中多余的PBS去除。

切勿移除充满内冲头的液体。为阻断通道，向每个出口加入1毫升阻断溶液。从出口孔以每平方厘米2达因的流速灌注待用孔，并持续灌注10分钟。

10分钟后停止灌注并移除接口。此时通道已准备就绪，可在对培养板进行胶原包被的同时于当天使用。在1小时孵育期间，应采集空腹个体的新鲜人血，用于后续成像及上板运行。

血液应采集至含柠檬酸钠抗凝剂的容器中，并在采集后三小时内使用。首先，将二甲基亚砜（DMSO）中浓度为4毫摩尔的钙储备液按1:1000（体积比）加入血液中，通过轻柔颠倒混匀，得到终浓度为4微摩尔的钙溶液。

接下来，将一毫升钙黄绿素标记的血液分装到十个1.5毫升的微量离心管中。按照所需稀释比例，向每根离心管中加入GP2B3A抑制剂抗体。务必设置无抗体阴性对照，并加入无关抗体作为阳性对照，通过轻柔颠倒混匀。

在进行流室实验前，将试管于室温孵育一小时，每10分钟轻轻翻转混匀一次。应在Bio Flux控制模块中为Collagen.One设置一个自动化程序，建立一个从出口以10 dyn/cm²的剪切应力运行血液10分钟的实验方案。

使用 BioFlex 1000 工作站时，应设置数据采集参数，包括在 fitz 波长下所需的载物台位置采集以及延时成像设置。本方案典型的图像采集计划为：每个通道使用 10 倍物镜，每 30 秒采集一个视野，持续总时长为 10 分钟。也可根据需要选择额外的视野或不同的延时成像设置。

在设置好自动程序和数据采集参数后，返回 BioFlex 培养板，除去通道两侧的液体，仅保留内孔部分。注意操作需迅速，将每种条件下的血液各 500 µL 加入各通道的输出孔中。请注意，此处使用输出孔来加入血液，是因为该路径到达观察区域的距离最短，可使血液对胶原涂层产生更迅速的反应。

此外，将未加抗体的对照血液分别加入涂有胶原蛋白的通道和仅进行封闭的通道中。将培养板置于 BioFlex 1000 工作站显微镜上，并固定接口。通过定位定义为原点的第一个校准点，执行载物台列表校准。

然后定位并标记第二个校准点。将此校准应用于相应的载物台列表中。这可确保培养板上的所有观察位置能够被自动找到。

移动载物台至含有血液的一个通道，使用 BioFlex 镶嵌软件设置图像采集参数，例如曝光时间和增益。通过点击相应按钮启动适当的流程，这将同时开始流式程序和图像采集。

实验结束后，将微流控板从BIOFLU 1000工作站中取出，并根据机构规定进行处理。使用生物流控系统中经胶原蛋白包被的微流控通道时，未经处理的对照血液样本会随时间推移出现明显的血栓形成。

相比之下，未包被的通道中未观察到血栓形成。在最近进行的一项实验中，对照条件下聚集体的平均面积为 2000 平方微米。GP IIb/IIIa 在血小板与血小板相互作用及聚集稳定中起关键作用，当血小板通过黏附于胶原被激活后，GP IIb/IIIa 发挥效应；如本实验所示，在剪切暴露前经抗 GP IIb/IIIa 抗体孵育一小时后，可观察到血栓体积减小，同时血栓形成频率也降低。

通常在10 dyn/cm²下可观察到剂量依赖性反应，该特异性抑制剂的IC50值为17 nmol。与无抗体对照相比，该供体在10 dyn/cm²下的最大抑制率为11%。此外，还可使用48孔高剪切力板进行全血实验，最高剪切力可达200 dyn/cm²或5,000 s⁻¹。

我们刚刚向您展示了如何利用微流控流动通道进行具有生理相关性的血管生物学实验。在执行本方案时，重要的是要记住使用正确的缓冲液稀释胶原蛋白。务必采用正确的移液技术，以避免引入气泡，并始终遵守您所在实验室的生物安全规定。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。