使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

本实验的总体目标是在体外模拟血小板输注，并通过在胶原表面发生止血的过程，结合流体动力学流动和实时显微镜观察进行检测。血小板减少症患者通常接受储存的血小板浓缩物治疗。我们的方法旨在帮助回答血栓形成与止血研究领域中的关键问题，特别关注储存血小板浓缩物的质量和功能。

该技术的附加价值在于其能够模拟血液流动，从而将流变学对参与细胞和生物分子的影响考虑在内。当前方法用于评估血小板与胶原的结合，但也可应用于其他黏附性组织，包括动脉粥样硬化斑块、内皮细胞，或特定基质蛋白（如血管性血友病因子和纤维蛋白原）。

首先准备生物芯片。将胶原蛋白储备液用厂家提供的等渗葡萄糖溶液按1:20的比例涡旋混匀并稀释，得到终浓度为50微克/毫升的溶液。然后，取0.8微升该溶液加入到新的一次性生物芯片的各通道中。

将芯片一端的所有泳道充满，并标记此端为出口端。然后检查芯片，确保每个泳道中有五分之六的空间已被溶液填充，且无气泡。随后，将芯片置于加湿密闭容器中，在4摄氏度下孵育4小时或过夜。

随后，通过将封闭缓冲液移液至泳道的另一端来封闭编码通道。然后为每个泳道截取12厘米长的管路，并在每段管路上安装一个针头，以便将其连接到生物芯片上。使用注射器和连接头以蒸馏水冲洗管路段。

然后，用封闭缓冲液充分浸润，并将它们密封于湿盒中，孵育至少一小时。接着，准备泵和歧管。首先，用蒸馏水冲洗泵和歧管，以去除所有气泡。

接下来，将生物芯片连接到自动显微镜载物台上。将管路的一端插入装有HBS的1.5毫升离心管中，另一端连接至生物芯片的进样口。将多通管路的针头插入生物芯片的出样口。

然后，使用泵以 HBS 冲洗系统。任何残留的封闭缓冲液或结合不牢固的胶原蛋白将由此被去除。至此，完成流室的准备工作。

首先将健康志愿者的新近血液样本收集并混入一个锥形离心管中。以约250 ×g的离心力离心约15分钟。不要使用刹车，因为这会扰动松散聚集的下层成分。移除并弃去富含血小板的血浆和白细胞层（buffy coat）。

保存浓缩红细胞，尽量减少其中的血小板含量，用于制备重组血液。现在，将4毫升AB型血浆在37摄氏度下解冻5分钟20秒。同时，使用全自动血液分析仪测定所制备的浓缩红细胞的血细胞比容。

然后，测定用于全血重建的血库制备血小板浓缩液的血小板浓度。计算制备1毫升、40%红细胞压积且每微升含250,000个血小板的重建血液所需的各组分体积。现在，使用剪去尖端的移液器吸头，将所需体积的红细胞、血浆和血小板浓缩液转移至目标浓度，最终体积为1毫升。

轻轻颠倒混匀重悬的血液，并进行全血细胞计数。然后取一支预先准备好的含有Calcein AM的微量离心管，向其中加入一毫升重悬的血液。再次轻轻颠倒混匀，使血液与染料充分混合。

然后，将重建的血液在37摄氏度下孵育5分钟。在软件中，选择灌注通道内的目标区域。在100倍放大倍数下，聚焦于通道底部附着的胶原纤维。

理想情况下，应使用相差显微镜或微分干涉差显微镜。选择“为选定的拼接区域设置当前Z值”选项，以数字方式固定选定的Z位置。灌注前的光学焦点应位于成釉细胞胶原上，但这可能较为困难。

另一种方法是将显微镜的焦距设定在最初附着的血小板上。随后，轻轻混匀样品，并将其放置在生物芯片旁边。然后，将连接至观察通道的管路放入重组血液中。

接下来，使用控制泵的软件，施加 50 dyne/cm² 的压力，使血样进入通道并开始实验。实验过程中，每 15 秒记录一次图像，持续 5 分钟。利用图像分析软件确定血栓生长动力学。

本实验采用 Zen 2012 软件。首先打开插件图像分析功能，以测定血小板的表面覆盖面积。在“分析交互”选项卡中设置荧光阈值，以定义与阳性信号相关的像素强度，该信号来源于黏附的血小板。

然后，使用创建表格功能自动生成电子表格，其中包含每个时间点阳性信号表面积的列表。将这些电子表格以 XML 格式保存，并在电子表格程序中打开以进行进一步计算。在每个时间点，计算所选对象的总表面积，并将该值表示为覆盖表面积的百分比。

然后，将数据以灌注时间为自变量作图，并通过线性回归计算斜率。该斜率可表征特定实验条件下的血栓生长动力学。同时对三份相同的重组全血样本在胶原包被的表面进行灌注。

这导致变异系数为8.7%，表明该检测在同一批次内及同一实验室内的变异程度可接受，适用于检测结果的比较。通过用缺乏的组分重新构建血液来模拟输注过程。进行了多次重构，血小板浓度逐步降低。

与预期一致，血小板计数较低时，随着灌注时间的延长，粘附作用减弱。接下来研究了血液采集后及灌注过程中温度降低的影响。当血液冷却至室温时，血栓形成速度减慢。

与在整个研究过程中保持在 37 摄氏度的样本相比，循环中的血小板在血管壁剪切应力升高的条件下会结合到血管损伤部位。正如预期，改变微流控流动室中的剪切速率会改变血小板的总黏附量。

这些条件也会改变血栓生长的动力学。观看本视频后，使用者应能够充分理解如何利用重组血液进行微流控流动腔实验，以检测储存血小板浓缩液的质量与功能。该技术的实验过程大约需要七小时完成。

微流控流动腔实验为血小板输注领域的研究人员探索捐献、制备和储存变量的影响铺平了道路。一个相关实例是病原体灭活。我们仅以一个实验主题为例进行了说明。

然而，通过改变钙离子浓度、剪切应力和表面涂层，可以针对不同的研究问题进行探究。与本实验方法类似，也可在微流控流动腔中进行其他测量，以回答更多科学问题。例如，可检测储存后的血小板在流动条件下的凝血功能。