用于评估增强子序列的嵌合体斑马鱼转基因技术

大家好，我是来自宾夕法尼亚大学细胞与发育生物学系Fisher实验室的Erica Kgi。我是Chris Weber，也来自Fisher实验室。我是Shannon Fisher。

今天我们将向您展示一种利用斑马鱼转基因技术分析增强子元件功能的方法。我们使用该方法研究在骨骼发育中起重要作用的基因的转录调控机制。现在就开始吧。

为了鉴定候选基因周围的非编码序列，我们使用了 fast cons 算法，该算法可在 uc SC 基因组浏览器上作为轨迹图层获取。我们主要关注在骨骼发育过程中表达的基因，但相同的方法也可用于研究早期发育中表达的任何基因。在本示例中，我们已鉴定出保守序列。

在人类 bumper 基因附近的区间内，我们检测该区间内相邻基因的全部序列，并确定一个对应于非编码序列中约前 5% 的低尺寸特异性对数得分阈值。在选定序列后，使用 Primer3 设计引物，从人类基因组 DNA 中扩增每一段序列；引物应选择用于扩增保守区域及其两侧各 30 个或更多碱基对的区域。使用高质量聚合酶和人类基因组 DNA 扩增目标区域，并采用标准实验室分子生物学方法将扩增产物克隆至表达载体中。

本实验方案中使用的载体为 PG wc FOS GFPA gateway，目的载体。在完成载体构建后，需进行转座操作。

用于转座的酶首先使用Ambion公司的M message M体外转录试剂盒以及PGB 600质粒在体外进行转录，然后用于实验注射。通过与已知增强子（如小鼠socks 10增强子）共注射来检测每批转座酶的活性。

为注射做准备，使用Sutter P-97型微电极拉制仪，将外径为1.2毫米的细丝毛细玻璃管拉制成显微注射用针头。采用一种可产生坚固尖端并具有锐利锥度的程序，以确保针头能够穿透完整的卵壳。在体视显微镜下用手动方式折断针尖，使其外径约为15微米。

针头可在加盖的培养皿中保存一天。在显微注射前一天，将斑马鱼群体维持在标准条件下的正常光暗循环中，光照时间为14小时。将鱼放入小型繁殖缸中，准备定时交配。

在微注射当天早晨光照周期开始后不久，将三条雌鱼或两条雄鱼并排放入每个水箱中。将雄鱼和雌鱼放入经清洁系统处理的水中进行配对，以促进产卵。频繁观察鱼类，并在产卵后几分钟内及时收集卵子，以获得同步性良好的卵批次。

通过上午持续使用带有乳胶吸球的宽口5.25英寸玻璃移液管将新鲜的鱼群组合在一起，维持产卵两到三小时。将收集的胚胎按每50枚一组分选至部分充有胚胎培养基的60毫米×15毫米培养皿中。在每个培养皿的皿盖上标记收集时间。

每次收集胚胎时，需保留一个含有50个胚胎的培养皿作为未注射对照组，置于两次卵收集之间。在微量离心管中混合以下成分，制备新鲜的注射溶液，并置于冰上保存。将注射针放置于盛放用的培养皿中，每根针内充入1.5至2微升注射溶液。

通过将500纳升液滴移液至每根针的宽端。液体将通过毛细作用被吸入针尖。每种注射溶液至少准备两根针。

将装满液体的针头装入气动皮升泵或类似压力注射器的手持式针头夹持器中，并根据制造商的说明连接至氮气罐。通过测量在显微测微载玻片的矿物油中排出液滴的直径来校准注射体积，通常注射时间为120毫秒。

在20 PS的压力下，使用6至10倍放大倍率的体视显微镜，可产生体积约为一纳升的液滴。用一对精细镊子固定胚胎，以稳定的压力将注射针穿过卵膜，插入处于单细胞或早期双细胞阶段胚胎的卵黄中，将针尖置于卵黄内、卵裂球下方，推出约一纳升的注射溶液，然后撤出针头。针对每种构建体，注射的胚胎数量大于或等于200枚。注射完成后，通过剔除未受精卵、受损胚胎以及注射失败或卵裂球中无酚红的胚胎，对胚胎进行筛选。

随后将胚胎及胚胎培养基置于28.5摄氏度下孵育，直至达到适宜的观察时间。接下来，我们将展示一些增强子元件的代表性结果，这些增强子可在斑马鱼胚胎中驱动GFP在特定组织中表达。我们研究在骨骼或软骨发育过程中表达的基因。

这是位于 acan 基因上游的一个增强子元件示例，可在受精后三天调控颅面软骨中的基因表达。这是另一个来自 bumper 基因的增强子，可调控成骨细胞中的基因表达。在我们已鉴定出的众多增强子中，截至第五天，发现增强子相对于基因的位置与其对表达的调控之间相关性较弱。

在选择待检测序列时，需要牢记的是，增强子可能位于基因上游或下游数百千碱基处，也可能位于内含子中，如此胚胎所示。大量序列似乎并不调控组织特异性表达，这些序列通常表现出极低的荧光信号，或仅在异位表达的两个常见部位——表皮和骨骼肌中出现少量散在的细胞。

我们刚刚向您展示了如何通过序列保守性来鉴定潜在的增强子元件，并通过斑马鱼的嵌合转基因技术来检测其功能。进行该实验时，重要的是要检查用于注射的DNA和RNA的质量。此外，务必仔细观察所有注射后的胚胎，特别是当您预期仅在少量细胞中表达时。

以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。