利用Gal4在斑马鱼中进行基因捕获

本实验的总体目标是利用携带 GAL4 和 VP16 作为主要基因捕获报告基因的载体，通过基因断裂型转座子技术产生突变鱼。该目标首先通过将基因捕获载体与 T2 转座酶共同注射到斑马鱼胚胎中来实现。注射后的胚胎在受精后三天进行 GFP 荧光筛选，并选择约 30% 荧光最强的胚胎用于建立 F₀ 群体。

接下来，将 F₀ 代鱼与 U-A-S-M-R-F-P 测试品系杂交，以筛选基因捕获事件的种系传递。最后一步是将 F₁ 代鱼进行远交，以建立 F₂ 代，并产生胚胎用于通过反向 PCR 和 5' 末端快速扩增cDNA法（5' RACE）对基因捕获事件进行分子表征。最终，大约每筛选 10 条 F₀ 代鱼中就有 1 条能够产生携带基因捕获的子代。

基因捕获型转座子被设计为在整合到蛋白质编码基因的起始位置时不会产生突变。我们的GBT载体使用G four P 16作为主要的基因捕获报告基因。这一修饰提高了对低水平表达基因的检测灵敏度，并使我们能够将基因捕获突变体作为G four驱动子，用于其他转基因在特定组织中的特异性表达，而无需担心出现过强的表型干扰。

我们认为本方法的主要瓶颈在于F零代鱼生殖系中实现足够高的基因捕获整合率。在本演示中，我们将介绍几个关键步骤：DNA制备、显微注射以及F零代筛选。GBTB1基因捕获载体使用GAL4-VP16作为主要的基因捕获报告基因。

使用两端带有最短高转座子进行基因捕获整合。基因捕获事件由受14 X GAL四UAS调控的EGFP报告基因直接检测。整个基因捕获盒的两侧由直接排列的P位点包围。

通过表达Cree重组酶，可使基因捕获事件具有可逆性，从而建立特定基因捕获整合与所观察表型之间因果关系的证据。此外，U-A-S-E-G-F-P盒两侧带有直接FRT位点。注射Flip重组酶mRNA将导致U-A-S-E-G-F-P盒的切除，使基因捕获突变不再带有EGFP荧光标记，从而可在转基因品系中使用；这些品系在显微注射前可通过GFP荧光标记特定组织或发育事件。

准备用于DNA转座和mRNA转座的转座子。制备GBTB单基因捕获载体DNA。使用标准的小量提取试剂盒并按照制造商的说明书操作，在制备DNA时必须包含PB洗涤步骤。

否则，质粒小提DNA将被RNA污染，进而导致转座子mRNA降解。将DNA溶解于无RNA水（RNase-free water）中，浓度稀释至每微升10纳克。为制备全长转座子mRNA，首先使用XboI酶对pT3TS-T2质粒进行线性化处理。接着，使用Mmessage Machine T3体外转录试剂盒对线性化DNA进行转录，操作中需进行一项修改。

在DNA处理步骤后加入0.5 µL核糖锁RNAs抑制剂，使用标准试剂盒纯化mRNA，并通过琼脂糖凝胶电泳评估体外转录mRNA的质量。将mRNA用无RNAs的水稀释至40 ng/µL，并在显微注射前分装为2 µL每份，于-80 °C保存。通过将8 µL稀释后的转座子DNA加入2 µL的转座子mRNA分装液中，制备注射混合物。

使用标准显微注射技术，将三纳升的 DNA-RNA 混合物注射到单细胞期斑马鱼胚胎的卵黄中，注射目标为卵黄与胚盘交界处。注射后，取五微升剩余注射液在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以质控确保转录的 mRNA 未发生降解。注射后约六至八小时，移除未受精及死亡的胚胎，并将存活胚胎以每100毫米培养皿60至80枚的数量进行分装。在受精后一天、两天和三天时，于配备荧光装置的体视显微镜或正置显微镜下，剔除形态异常及死亡的胚胎。

筛选胚胎并移除任何异常的胚胎。对剩余无明显缺陷的胚胎进行筛选。对于GFP荧光，选择荧光最强的F零代胚胎，并采用本实验室标准的斑马鱼培育方法进行培养。

通常将GBT注射到具有野生型或豹纹色素模式的品系中。预计在选择培育的注射胚胎中，有20%至30%能够存活至成年。GBTB单基因捕获载体的整合可通过两种不同的机制导致EGFP表达。

第一种是真正的基因捕获事件。载体插入到一个基因中，形成一个融合转录本，该转录本包含内源基因转录本的5'端与GAL4-VP16的融合序列，并被翻译成一种融合蛋白，该蛋白含有目标蛋白的C末端，并由插入的突变基因与GAL4-VP16共同构成。此融合蛋白可结合14个UAS序列，并激活EGFP的转录。

第二种较不理想的情况是增强子捕获。位于EGFP前方的最小启动子受到整合位点附近增强子的调控，导致在没有GAL4、VP16的情况下产生EGFP。为了区分这两类事件，构建了一条带有晶状体特异性γ-晶状体蛋白GFP标记的14 X-U-A-S-M-R-F-P转基因品系。

通过将GBT显微注射的鱼与纯合的U-A-S-M-R-F-P鱼杂交，并筛选GFP与RFP的共表达来验证基因捕获事件，只有当GAL4与VP16表达并反式激活U-A-S-M-R-F-P时，才会启动F零代鱼的筛选程序。具体操作为：将单个F零代鱼与纯合的U-A-S-M-R-F-P鱼杂交。由于GBT显微注射的鱼具有野生型或豹纹色素模式，而纯合的U-A-S-M-R-F-P品系处于brass背景中，因此F零代鱼可轻易与U-A-S-M-R-F-P鱼区分，从而无需记录待筛选F零代鱼的性别，也避免了因记录或判断每条鱼性别时可能出现的错误。次日。

将黄铜制的U-A-S-M-R-F-P鱼放回鱼缸中。将产下胚胎的F零代鱼放入单独的静水鱼缸中，同时收集胚胎用于筛选，并在第零天下午将收集的胚胎转移至新的培养皿中。在受精后一天和受精后三天对胚胎进行GFP和RFP荧光筛选。

挑出同时对 GFP 和 RFP 均呈阳性的胚胎，并根据 G-F-P-R-F-P 表达模式进行分选。如果在一窝胚胎中观察到多种表达模式，则将其培育以建立 F1 代。需要注意的是，对 GFP 阳性但对 RFP 阴性的 3D PF 胚胎不进行挑出，因其代表增强子捕获事件。

将产生G-F-P-R-F-P阳性后代的F零代鱼再次杂交，以获得第二批阳性后代。对F1代鱼进行筛选，建立F2家系，以记录基因捕获（gene trap）的表达模式，并冷冻保存胚胎批次用于基因捕获位点的分子鉴定。首先在次日将单个F1代鱼与纯合的U-A-S-M-R-F-P鱼杂交。将成功产卵的F1代鱼移入单独的静水养殖缸中，同时收集受精后一天的胚胎用于筛选。

RFP 标记可能尚未显现，因此在受精后三天对胚胎进行 GFP 荧光筛选，挑出 GFP 阳性的胚胎；随后在受精后五天对 GFP 和 RFP 荧光同时进行筛选，挑出双阳性胚胎。接着对同时呈 GFP 和 RFP 阳性的胚胎进行拍照，并将 20 个 G-F-P-R-F-P 阳性胚胎和 20 个 G-F-P-R-F-P 阴性胚胎分批冷冻，用于通过反向 PCR 和 5' 端快速扩增 cDNA 末端（5' RACE）技术鉴定插入突变基因。将剩余的 G-F-P-R-F-P 阳性胚胎继续培养，以在成功注射的情况下建立 F2 代。

至少80%注射了基因捕获DNA和转座酶mRNA混合物的胚胎会表现出一定程度的GFP荧光。GFP表达水平较低表明注射未成功，或由于RNA污染导致转座酶RNA降解。当选择GFP荧光最强的胚胎建立F₀群体时，每筛选约10条F₀鱼，其中约有1条会产生基因捕获后代，从这些F₀鱼中可回收到基因捕获事件。

大多数除了整合多个不表达的转座子外，还传递单个基因捕获事件。由于整个基因捕获盒的两侧均为直接重复的P位点，图中以蓝色框表示突变基因外显子的任何基因捕获突变均可通过表达CRE重组酶而逆转。这些图像显示了NSF TP六号基因捕获品系神经系统中GFP与RFP的共表达；向NSF TP六号胚胎注射Cree RNA后，导致GFP与RFP表达的丧失。

请注意，晶状体中GFP表达未出现预期的降低。此处概述的大多数步骤同样适用于其他基因捕获筛选，以及使用TOL2和其他转座子进行的常规转基因实验。采用此处所述的基因捕获方法，每周建立20至30个F₀代杂交组合，预计每周可获得一个基因捕获事件。

然而，该步骤可轻松扩大规模。