用于植物组织基因表达研究的机器人技术与动态图像分析

在此实验过程中，利用机器人系统随时间成像植物组织中基因表达的动态变化。首先将利马豆种子进行表面灭菌，然后置于湿润的滤纸之间，并放入组织培养容器中以促进萌发。四天后，取下子叶并用含有启动子与绿色荧光蛋白（GFP）融合的DNA构建体进行基因枪轰击。将处理后的子叶放置于培养皿中，并固定在自行设计的二维机器人图像采集系统上。该机器人被编程为每小时对每块组织进行一次图像采集，持续100小时。

图像经过图像分析，获得随时间变化的GFP表达强度的定量数据。大家好，我是约翰·菲纳（John Finer），俄亥俄州立大学园艺与作物科学系植物转化实验室主任。我是卡洛斯·埃尔南德斯·加西亚（Carlos Herandez Garcia），俄亥俄州立大学菲纳实验室的博士研究生。

今天，Carlos 将向您展示我们开发的利用绿色荧光蛋白分析基因表达和植物组织的实验方案。我们在实验室中采用此方法测定OD活性。为此，我们将目标启动子置于GFP基因的上游，GFP基因即为我们的报告基因。

我将向您展示如何将启动子控制引入利马豆的维管组织，并通过我们定制设计的机器人图像采集系统发送应用程序。最后，我将介绍图像分析的实验方案。现在开始，首先按照标准操作程序对利马豆种子进行表面灭菌。

将灭菌后的种子置于Magenta GA7容器中，夹在湿润的纸巾层之间，在25摄氏度下培养四天。此处我们使用高拷贝数表达载体，适用于启动子及启动子元件的分析。该载体含有GFP基因，可用于在转化组织中观察启动子或启动子元件的功能，观察时间通常在轰击前约一至两小时。

从利马豆种子种皮中切除CU小叶。用于轰击的CU小叶应呈黄色至浅绿色，扁平且无任何可能干扰切除后立即进行图像分析的损伤。将12个CU小叶置于含有MS盐、B5维生素、3%蔗糖和0.2%凝胶琼脂（pH 5.7）的OMS培养基的培养皿中。接下来，将DNA构建体沉淀到M-10钨颗粒上。首先，在使用前立即将颗粒重悬于无菌水中，浓度为100毫克/毫升。

然后，在一个0.6毫升离心管中，加入25微升颗粒、5微升浓度为1微克/微升的DNA、25微升2.5摩尔氯化钙以及10微升100毫摩尔亚精胺。将DNA样品置于冰上孵育5分钟，随后移除并弃去颗粒上方50微升的溶液。通过涡旋振荡重悬管底残留的DNA包被颗粒。

涡旋后立即取两微升Eloqua。每次取出Eloqua后，重复此涡旋步骤。包被的颗粒应始终保持在冰上，并在15分钟内使用。

现在DNA已包被到微粒上，取两微升微粒溶液，从位于滤膜筛中央的注射器滤器顶部加入。然后将该注射器滤器放入粒子喷射装置（PIG）腔室内的滤器固定单元中。将一颗利马豆平放在挡板上，使其轴向朝上，该挡板由一张金属筛网熔接到烧杯底部构成。

将挡板放入基因枪室中，该挡板用作在轰击过程中支撑组织的平台。开始轰击组织时，首先打开通向真空系统的阀门，以抽空室内空气。当真空度达到760毫米汞柱时，启动电磁阀，释放氦气以推动微粒。

用于加速粒子的氦气压力为50至60 PSI。粒子轰击完成后，关闭真空管路阀门，并通过排气阀释放真空。当真空释放后，打开腔室门取出被轰击的co leadin，并将co leadin放回dal侧。

使用OMS培养基进行定量和表达谱分析。每种DNA构建体至少轰击三个共引导样品。同时包括一个具有已知基因表达谱的阳性对照。

共聚焦样品现在已准备好进行成像。打开汞灯，并等待30分钟使灯预热。打开SPOT R-T-C-C-D相机和电机控制器的电源，后者用于驱动定制设计的可承载八块培养板的机器人平台的运动。

在 MZ L3 体视显微镜上选择激发波长为 480 纳米、发射波长为 510 纳米的 GFP 双滤光片组，以设置用于 GFP 检测的滤光片组。接着，用 70% 乙醇喷洒加厚的聚碳酸酯培养皿盖进行灭菌。这些专用的皿盖用于覆盖培养皿底部，可在图像采集过程中防止冷凝水形成。

将含有经轰击处理的铜板放置于机器人平台上，并拧紧侧向固定螺钉以固定其位置。现在打开用于控制机器人平台和图像采集的自定义软件程序。同时通过软件打开软件白光控制器开关，并将平台调整至初始位置。

此操作在输入位置之前完成。对于电机选项卡中的每个引导线，选择第一块培养板。平台将把培养皿的中心定位在显微镜物镜下方。

使用移动距离按钮精确定位第一个CU引导位置以进行图像采集。在实时模式下，将cuddle引导移动到合适的观察区域。对于第一个cuddle引导，使用解剖显微镜上的手动旋钮调节焦距，并将放大倍数设置为1.6倍。一旦确定了目标区域，点击“添加此位置”按钮。

软件会将该区域的坐标添加到位置计划文件中，平台将返回到所有剩余孔板上预设位置的中心。使用移动距离按钮，调节机器人平台每个孔板下方的三个手动调平螺丝，以调整同一孔板上其余孔的焦距。在输入所有孔的坐标后，保存位置计划坐标。

输入图像采集参数，例如光照类型（GFP 使用蓝光）和曝光设置，并按照随附书面方案中的说明指定图像存储位置。进入捕获时间控制选项卡，设置图像采集的时间间隔和图像采集的总循环次数。通常每小时采集一次图像，持续 100 小时。

生成明确的基因表达谱。通过打开位置时间表选项卡，然后点击运行时间表按钮，开始图像采集。在100小时图像采集结束时，将图像采集系统与外界光线隔离。

每个约五兆字节的高分辨率图像已准备好进行图像分析。使用图像处理软件将每个文件夹中的100张连续图像组合起来。将所有连续图像作为帧导入，并调整大小为800×600像素，以加快图像处理速度。

接下来，使用新引入的图层上的标记，该图层在所有帧中均可见，并以图像参考中选定的 GFP 斑点为依据。手动对齐每幅图像，对齐完成后，删除用作参考的图层，并将文件保存为单个 PSD 文件。同时，以最高分辨率将所有帧导出为单个 MOV 文件。

文件现已准备就绪，可开始进行GFP定量。使用ImageJ打开MOV文件，并裁剪出一个400乘以300像素的区域。然后使用RGB分割工具将序列图像分离为红色、蓝色和绿色通道，用于红色和绿色通道。

使用“减去每个切片测量的感兴趣区域（ROI）”插件工具扣除背景荧光。通过调整阈值水平，并使用专门用于测量每个像素的平均灰度值及表达GFP的像素总数的插件，计算GFP表达量。将ImageJ中的输出值复制，最后将绿色和红色通道的输出值粘贴至Microsoft Office。

Excel 用于进一步的数据处理，以展示图像配准的结果。此第一段动画显示了在 100 小时实验期间机器人平台重新定位的不准确性。斑点移动是由于机器人平台在每次手动图像配准后无法精确返回到完全相同的位置而产生的伪影，表达 GFP 的细胞可以被清晰观察到，该追踪系统的独特特征也易于可视化。

随着此动画的重复播放请注意，被圈出的表达GFP的细胞中，红色圆圈标记的细胞在轰击后18至20小时表现出GFP表达的迅速下降，而白色圆圈标记的细胞则显示出GFP表达的延迟启动。除了动画之外，该方法还可实现对菜豆靶组织中GFP表达随时间变化的快速定量分析。这些代表性结果展示了利用CAMV 35S启动子与四种不同大豆启动子进行的启动子强度比较定量分析。

我们刚刚向您展示了如何将 DNA 导入萌发的菜豆子叶中。利用 Lima 脉序种子，将菜豆子叶放置在机器人上，采集图像用于图像分析，并对这些图像进行分析。我们实验室常规使用该方法来验证克隆植物启动子。

通过引入不同的植物启动子，可以获得大量数据。然而，该实验流程步骤繁多，操作复杂，容易出错。进行此操作时，必须使用新鲜的菜豆种子，或至少使用储存得当的高质量种子。此外，需迅速完成基因枪轰击用培养皿盖的制备并将其安装到机器人装置上，同时使用较厚的培养皿盖以尽量减少冷凝问题。

最后，请注意我们使用的 GFP 是另一种版本，称为 SGFP，来自哈佛大学的 Gen HIN 实验室。这种 GFP 不够稳定，因此可能更适合追踪基因表达的快速变化。感谢您观看我们的视频。

祝您的实验顺利。