利用可变角度落射荧光显微镜对植物细胞表面动态进行实时成像

本实验的总体目标是利用变角落射荧光显微镜观察荧光标记蛋白在植物细胞表面的运动。该方法有助于推动植物细胞生物学领域的发展，例如揭示蛋白质在植物细胞表面的作用机制。该技术的主要优势在于，能够在开始实验前实时观察荧光标记蛋白的动态行为。

根据制造商的说明校准显微镜的激光居中和聚焦。然后使用物镜无光路遮挡的路径，找到显微镜室天花板的中心位置，并用彩色标签标记该位置。接着，用物镜照射天花板，并将照明区域移动至中心位置。

然后聚焦激光，并微调激光位置至天花板中心。激光的居中与聚焦对于成功进行变角照明落射显微观察（VAEM）至关重要。在开始实验前，用户应接受显微镜公司专业人员的培训。

当显微镜准备就绪后，将30 µL基础缓冲液滴加到76 mm × 26 mm玻璃载玻片的中央。然后使用解剖剪从七日龄幼苗上切下一片子叶，并将子叶的观察面朝上漂浮于基础缓冲液液滴中。接着，再将30 µL基础缓冲液滴加到18 mm × 18 mm盖玻片的中央。

盖上盖玻片，并将盖玻片翻转朝下。用镊子夹住盖玻片的一边，轻轻操作，利用表面张力防止液滴脱落。将盖玻片的对侧边缘放置在玻片上，使缓冲液位于共引线之上。

然后将盖玻片的一边保持接触载玻片，调整液滴位置，使其正对石蜡样本上方，再缓缓放下盖玻片。若无气泡产生，用无绒纤维纸巾擦去多余的缓冲液，并立即将样本转移至显微镜下观察。

使用明场照明选择待观察的细胞。接着，确认可观察到荧光蛋白，并使用落射荧光照明将Z轴位置设定在细胞表面。进行VAEM时，使用控制器盒调节激光束的入射角度。

在密切观察实时图像的同时，逐渐调整。最初，图像会显得模糊。随着激光角度的增加，VAEM图像的模糊程度将逐渐降低，最终获得清晰的图像。

此时停止增大激光角度。现在进行精细调节，调整激光入射角度以获得更清晰的图像，并根据需要调节光学参数和图像传感器参数。

然后使用商用显微镜软件，以多页TIFF图像文件格式采集一段视频。此处的视频显示了GFP标记的点状结构在STA模型细胞表面闪烁。为了使用Fiji量化GFP标记的点状结构停留时间，请进入文件打开菜单，打开所获取的多页TIFF文件。

使用直线选择工具在感兴趣的一侧放置一条直线。接着，使用图像堆栈动态重切片插件生成图像图表。随着直线的变化，图像图表将动态更新。

通过“文件”菜单中的“另存为 TIFF”选项将图像保存为 TIFF 文件。随后，为了进行降噪处理，请进入“处理”→“滤镜”→“高斯模糊”菜单，对纹影图像应用高斯滤波器。根据需要适当调整西格玛半径参数。

使用图像调整阈值工具，通过设定阈值分割信号区域，并打开“分析”菜单中的“设置测量值”选项。接着，在“设置测量值”窗口中勾选“边界矩形”，并选择尽可能小的最小像素数。然后，在“分析”菜单下选择“分析粒子”选项。

根据Y轴测量目标点的时间，查看显示结果，并添加到管理框中以查看数据值。最后，在结果表菜单下，选择“文件”、“另存为”，并使用适当的分析软件处理点图像持续时间的数据集。此处显示的是通过chm图分析法测得的第十二个独立亚细胞中185个GFP巡逻一点在第八代edin中的停留时间，如图所示。

拟合的密度函数显示，大多数GFP巡逻一斑点在副细胞中的停留时间为2到10秒之间，峰值约为3.5秒。这表明副细胞表面质子泵存在快速的胞吐和胞吞过程。通过本视频的学习，您应能充分理解如何利用变角落射荧光显微镜对植物细胞表面的野生型蛋白动态进行可视化和定量分析。