多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

本视频演示了刺激和染色外周血单个核细胞（PBMC）的实验步骤。为了进行多色流式细胞术分析，将从全血中分离得到的PBMC置于组织培养板中。通过化学或生物学方法刺激细胞，以诱导其产生免疫应答。

刺激后，加入抗体混合物，以根据细胞表面标志物的表达来鉴定细胞类型。随后对细胞进行透化处理，并加入另一组抗体混合物，以检测细胞内细胞因子的表达，然后通过流式细胞术分析细胞，确定外周血单个核细胞（PBMC）特定亚群的细胞因子谱型。大家好，我是艾米·考特尼（Amy Courtney），来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心免疫学系贾甘·萨斯（Jagan SAS）博士的实验室。

大家好，我是来自实验室的Hong her。今天我们将向您展示一种T细胞反应的多重细胞分析技术。我们在实验室中使用该方法来研究恒河猴（Reus Maca）的细胞免疫反应。

那么我们开始吧。首先使用血细胞计数板，通过台盼蓝染料排斥法测定来自Reuss Maca的外周血单个核细胞（pbmc）的活细胞数量。操作过程需在层流罩中进行。

将细胞重悬于完全培养基中，浓度为每毫升1000万个细胞，取100微升细胞悬液加入96孔组织培养板的每个孔中，用于非特异性刺激。然后加入100微升含有PMA和CIN的培养基，使总体积达到0.2毫升，终浓度为50纳克/毫升PMA和500纳克/毫升CIN；对于阴性对照孔，则每孔仅加入100微升完全培养基。加样后，将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育1.5小时。

向培养物中加入终浓度为10微克/毫升的佛波酯A（felden A），并在37°C下继续孵育4.5小时。加入佛波酯A可激活细胞内的细胞因子，使其在金G装置（gold G apparatus）中通过免疫染色更易被检测。刺激完成后，离心去除培养基，然后加入200微升冷的流式洗涤缓冲液，低速离心。重复洗涤一次，最后重悬于50微升流式洗涤缓冲液中。

细胞现已准备好进行表面标志物染色，可将染色试剂加入重悬细胞的每个孔中。根据生产商的说明书，向每孔加入1 µL可固定的活死细胞蓝色荧光反应性染料。在细胞孵育期间，于4°C避光孵育30分钟。

准备将在微管中用于染色的溶液。首先，配制一种混合染色液，其中应包含以下适当成分：滴定过的荧光标记单克隆抗体，抗 CD3 PE-Cy7、抗 CD8 Alexa 700、抗 CD28 PerCP-Cy5.5、抗 CD95 APC 以及抗 CD4 Pacific Blue，并加入流式洗涤缓冲液。

接下来，制备补偿对照，通过为每种荧光标记抗体单独制备单色染色管，用于确定每种染料对其他检测通道的溢出系数。最后，制备荧光减一（FMO）对照，将所有试剂组合在一起，仅缺少待检测的目标试剂。该对照将用于确定阳性与阴性群体之间的界限，通过模拟完全染色样本中的自发荧光水平和数据来实现。

细胞在活死染料中孵育后，用冷的流式洗涤缓冲液洗涤一次，以去除多余的染料，吸去洗涤缓冲液。然后加入配制好的染色溶液，在4°C避光条件下孵育30分钟。

用预冷的流式洗涤缓冲液洗涤染色后的细胞，以去除多余的抗体。然后加入100微升BD固定破膜溶液，孵育至少10分钟。将细胞在4°C避光条件下保存，最长可保存24小时，直至后续使用；或继续进行细胞内细胞因子的标记。

首先在 100 微升 1 × 破膜缓冲液中对细胞进行透化处理。将细胞在 4°C 避光孵育 10 分钟，同时在 1 × 破膜洗涤缓冲液中制备染色抗体、补偿对照和 FMO 对照，方法同前。

细胞孵育10分钟后，离心并弃去一倍体积的破膜洗涤缓冲液。加入适量的染色抗体。随后，在避光条件下，于4°C将细胞与抗体共同孵育60分钟。

用透化溶液洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于含1%多聚甲醛的DPBS中以固定细胞。将细胞置于4°C避光保存，最多可保存24小时，直至使用。

细胞染色后，使用 LSR 两色流式细胞仪或 Cyan ADP 流式细胞仪进行检测。然后使用 FlowJo 或类似软件分析数据。采用流式细胞分析法测定雷氏马卡中的外周血单个核细胞（PBMC）组成。

该图展示了一个代表性动物的不同T细胞亚群分析所采用的设门方案。首先通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）对淋巴细胞进行设门，然后根据SSC及AQUA染色阴性群体确定活淋巴细胞。T细胞通过CD3表达进行鉴定，并在CD3阳性T细胞群体中进一步确定CD4阳性、CD8阴性群体以及CD4阴性、CD8阳性群体。

根据CD28和CD95的表达情况，将CD4阳性与CD8阳性T细胞进一步区分为不同的亚群，即初始型、中央记忆型和效应记忆型细胞。该图显示了未刺激以及PMA/离子霉素刺激条件下，CD4阳性T细胞及其亚群中干扰素γ和IL-2的产生情况。

注意不同细胞亚群在刺激后产生的独特细胞因子谱。我们将向您展示如何对 PBMC 进行多色流式细胞术分析。

进行此操作时，务必要记住设置单色补偿对照和荧光减一对照。这两种对照对于流式细胞术数据的正确分析都至关重要。有关选择补偿对照的更多信息，请参阅我们的书面实验方案。

此外，请注意在使用荧光标记抗体时，必须遮盖样品以避免光照。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。