从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4⁺ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

该方法有助于回答宿主-病原体相互作用领域中的关键科学问题，例如：被高效感染的细胞具有哪些独特特征？哪些宿主辅助因子能够促使病毒建立高效感染？以及如何在治疗干预中靶向这些细胞？本技术的主要优势在于，它能够在单细胞水平上同时提供蛋白质和 mRNA 的定量测量，且大多数试剂均可从商业渠道获得。细胞分选操作的演示将由迈克尔·埃勒博士实验室流式细胞术核心 facility 的高级技术员 Matthew Creegan 完成。

首先，在指定的预扩增分子生物学工作区中，将96种基因表达检测引物加入无RNase和DNase的离心管中，配制检测反应液，确保每种引物的终浓度为180纳摩尔的正向和反向引物。加入DNA悬浮缓冲液，将检测反应液稀释至适当浓度。针对每个预期使用的96乘96芯片阵列，将每种检测反应液各6微升移取至96孔PCR板的指定孔中，然后用封口膜密封该PCR板。

开始对活细胞进行表面染色时，在组织培养生物安全柜中，首先按照文本方案制备补偿样品以及荧光抗体混合液的总工作液。将冻存的细胞在37摄氏度水浴中解冻两分钟。随后，将5至2毫升细胞悬液加入含有12毫升PBS的15毫升离心管中。

在25摄氏度下以500 G离心三分钟，然后吸除PBS，并将沉淀重悬于3毫升新鲜PBS中。将此混合液转移至一个5毫升聚苯乙烯管中。再次在25摄氏度下以500 G离心三分钟。

吸出上清液，留下约10微升残留的PBS。接下来，将最多2000万个洗涤后的细胞重悬于80微升抗体混合液中。在25摄氏度避光孵育20分钟。

此后，加入三毫升 PBS。在 500 ×g 下离心三分钟，并吸除上清液。将细胞充分重悬于 300 至 500 微升 PBS 中。

使用移液器将该溶液通过35微米尼龙细胞筛帽过滤。随后将细胞置于冰上，并避光保存直至分选。返回PCR前工作站后，首先根据文本方案中的说明，在一个无RNase、无DNase的无菌管中配制RT预扩增反应混合液。

使用多通道移液器，将 10 微升该反应混合液加入所需数量的 96 孔 PCR 分选收集板中。用粘性封膜密封反应板，然后将反应板置于预冷的 96 孔铝块上。随后，根据文本方案中所述建立细胞分选门控策略，并准备流式细胞分选仪。

输入适当的仪器设置，以指定分选到每个孔中的细胞数量和细胞亚群。移除粘性封膜，然后将细胞通过流式细胞分选（FACS）分选至预先准备好的96孔PCR收集板中。使用新的粘性封膜重新密封板孔。

立即涡旋振荡重新封膜的反应板，然后在4 °C条件下以2000 ×g离心1分钟。将反应板放入预热至50 °C的PCR仪中，50 °C孵育15分钟，随后95 °C孵育2分钟。最后，进行18个循环的扩增：95 °C变性15秒，60 °C退火4分钟。扩增结束后，在PCR后处理工作站中，将5 µL cDNA转移至新的96孔PCR板中，加入20 µL DNA悬浮缓冲液。

首先，通过向每个孔中加入四微升的引物-探针混合液来准备qPCR检测板。接下来，将2X引物-探针混合板中的每种检测引物-探针溶液各取四微升转移至qPCR板中。将qPCR检测板保持在4摄氏度。

将引物注射器中的控制液注入芯片的两个进样阀中。取下板下方的保护塑料膜。将芯片放置在IFC控制器上，使缺口一侧位于A1位置，然后选择并运行引物程序。

对于每个微流控芯片，将 50 微升样品加载试剂与 500 微升 PCR 预混液混合，以制备实时反应混合液。将 4.4 微升该反应混合液移液至新指定为样品板的 96 孔 PCR 板的每个孔中。接着，将 3.6 微升先前稀释的 cDNA 移液至样品板的每个孔中。

此后，从检测板中转移五微升至芯片缺口侧的对应孔中。从样本板中转移五微升至芯片另一侧的对应孔中。将加载好的芯片插入IFC控制器，并运行load mix程序。

接下来，将芯片转移至 BioMark 平台，并按照文本方案中所述设置仪器，然后将芯片运行文件保存至指定文件夹。芯片运行完成后，打开实时 PCR 分析软件，选择“文件”菜单中的“打开”，以打开 chiprun.bml 文件。

在软件窗口的左上角，找到芯片浏览器和芯片运行摘要。在芯片运行摘要下，点击检测器设置。在任务下，点击新建并选择容器类型 SBS 板和容器格式 SBS 96。

单击映射旁边带有省略号的按钮，然后选择 M96-Assay-SBS96.dsp。单击分析视图。在任务下的 qPCR 选项卡中，为线性导数选择基线校正，为用户检测器选择 CT 阈值法。

在 CT 阈值选项卡中，勾选“自动初始化”复选框，然后点击“分析”按钮。在分析视图的右上象限中，点击第二个标签页“结果表格”。从下拉菜单中选择“热图视图”，带有数据的热图将随之显示。

在热图下方，点击阈值和对数图。通过点击热图上代表各检测项目的列，并根据需要拖动阈值，手动调整每个检测器的循环阈值（CT），使其与扩增曲线的指数相交。完成后，点击“分析”。

接下来，将 qPCR 数据导出为 csv 文件。将 qPCR 数据从 BioMark 计算机传输至您的桌面。将数据导入电子表格或统计分析软件，并根据芯片上的样本和检测位点位置对结果进行映射。

创建一个新列，并使用条件公式根据病毒基因的表达情况将细胞分组。在“分析”下选择“以 Y 拟合 X”，并绘制基因表达相对于组别的图表。然后，使用 FlowJo 9 版本打开对应于 96 孔板的 FACS 分选生成的 FCS 文件。

在高亮显示文件名后，选择平台、事件数门控，并创建索引分选门控。单个细胞将按行显示。选中全部96个细胞，然后选择工作区、导出，选择所有已补偿的基线值。

在数据下选择 FCS 文件，点击导出，并选择一个指定文件夹。将各个细胞的新 FCS 文件拖入一个新的 FlowJo 工作区。选中所有细胞，然后点击由西格玛按钮表示的“添加统计”，选择均值以及所有荧光参数。

打开表格编辑器，然后选中第一个单元格的所有楼层，并将其拖动到表格编辑器窗口中。在此窗口中，单击“创建并查看表格”。随后，通过复制粘贴或单击“保存并启动应用程序”按钮，将结果复制并输出至统计分析软件中。

通过孔板编号和孔位，在 JMP 软件中将单细胞 FACS 数据与 qPCR 数据进行整合。最后，对整合后的数据进行图形化和统计学分析。在本研究中，采用多参数流式细胞术对单细胞表面蛋白进行定量，并结合高度多重的逆转录定量 PCR（RTqPCR）对单细胞 mRNA 表达进行定量分析。

图中显示的是经FACS分选的恒河猴CD4阳性T细胞的单细胞定量病毒基因表达。Tat/rev阳性N阴性细胞中tat/rev RNA的拷贝数少于深绿色所示的N阳性细胞，这与感染早期阶段一致，即在病毒RNA部分剪接并输出细胞核之前。在tat/rev阳性N阳性细胞中，未剪接Gag-RNA的高丰度与晚期 productive 感染阶段一致，此时大量基因组RNA被表达并包装进入出芽的病毒颗粒。

该三变量图显示了单个细胞的病毒基因、宿主基因和宿主表面蛋白的表达情况，表明尽管 CD4 和 CD3 的转录本得以维持，但在呈绿色的 tat/rev 阳性细胞中，表面 CD4 和 CD3 蛋白的表达量降低。掌握该技术后，可在两到三天内完成实验。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展靶向单细胞蛋白-转录联合分析，以研究病毒感染细胞中差异表达的基因和蛋白相关问题。