使用FM染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

以下实验的总体目标是利用活细胞荧光成像技术，定量分析中枢神经末梢中特定突触囊泡池的补充与动员过程。该目标通过在同一神经末梢中使用 FM 染料监测两轮突触囊泡循环来实现，从而提供有效的内部对照。第二步，采用特定的卸载方案依次耗尽易释放池和储备池，以定量各囊泡池的相对大小。

接下来，改变加载或卸载条件，以研究所选变量对突触囊泡、囊泡池补充或动员的影响。结果表明，基于诱发染料卸载的定量与分析，不同突触物理池的 FM 染料加载具有可重复性。该技术相较于现有方法（如荧光蛋白基因报告系统）的主要优势在于，该技术能够特异性地追踪经历内吞作用后的突触囊泡对囊泡池的补充过程。

它还能够实现精确的定量分析。由于该方案在同一神经末梢中重复进行两次，从而提供了内部对照。该方法有助于回答突触、CLE、内吞和外排领域中的关键科学问题，例如，对特定内吞模式的调控如何影响总循环池及其内部的突触 CLE 池（如易再利用池和储备池）的补充。

基本实验装置应包括倒置荧光显微镜、冷却 CCD 相机、荧光光源、重力灌流装置、带有平行铂电极的成像室和电刺激器，以及一台计算机。实验应在黑暗或红光条件下进行，并尽量减少对样品的荧光照射，以避免 FM 染料漂白。本实验程序首先使用出生七天的 spra dolly 大鼠幼崽制备小脑颗粒神经元的原代培养物。

培养物制备完成后，将神经元接种于经多聚赖氨酸包被的25毫米盖玻片中央，形成液滴，一小时后液滴直径不得超过7毫米。七天后，向神经元中加入2毫升培养基。随后，将单个盖玻片置于室温下的生理盐水中10分钟，使其在新培养基中稳定。之后取出盖玻片，用一小块纸巾或吸水纸擦干其底面以及细胞附着区域周围的液体。

随后，使用硅脂将盖玻片粘接到成像室的底部。细胞应位于两根平行导线之间。使用足量的硅脂将成像室完全密封，但不要侵入浴室中心区域。

接下来，轻轻向浴槽室中加入约 260 µL 生理盐水溶液。然后用相同溶液填充输入和输出管路。使用硅脂将一块洁净的盖玻片粘合到顶部，以密封室腔。

随后，使用进液和出液管路排除腔室中截留的任何气泡。然后将成像室固定在不锈钢平台上。通过进液管路缓慢灌注生理盐水，检查是否存在泄漏。

下一步是将组装好的腔室安装到倒置显微镜的载物台上。用生理盐水溶液预充重力灌流系统的入口，然后将腔室连接到入口。接着将腔室的连接导线接到电刺激器上。

用1.5毫升稀释的FM染料灌注神经元。随后使用连接的刺激器刺激神经元，以诱导染料内吞。刺激后，用新鲜的生理盐水溶液灌注神经元2分钟，以洗去多余的FM染料。然后将神经元在生理盐水中保持8分钟。

在此期间，利用荧光素波长定位可观察到单个 FM D 荷载神经末梢的轴突网络，避开细胞成簇的区域。

在图像采集前立即重新对焦，因为在休息期间可能发生轻微漂移。以每四秒一帧的速率开始延时图像采集。采集5到10个基础图像后，通过施加30赫兹、持续两秒的刺激，诱发易释放囊泡池的胞吐作用。

再获取10张图像后，使用三次40赫兹、持续10秒的刺激（刺激间间隔40秒）诱发突触囊泡储备池的胞吐，随后再获取5到10张图像。然后暂停图像采集，让神经元恢复至少20分钟，并在S二相中重复此S一相实验方案，作为对照实验。

进行数据分析时，将图像转换为堆栈。使用 ImageJ 内置功能，若出现明显的水平漂移，则调整堆栈的亮度和对比度以最大化动态范围。在实验过程中，在 ImageJ 中运行 StackReg 和 TurboReg 插件以对齐图像堆栈。

然后使用时间序列分析插件。接下来，在至少90个神经末梢上定义感兴趣区域。在卸载染料前后的图像之间进行切换，有助于识别出活跃的神经末梢。

理想的感兴趣区域大小应略大于典型的神经末梢。然后获取每个感兴趣区域随时间变化的总荧光强度。之后，导出至 Microsoft Excel。

此处展示的流程图描述了一项对照实验，其中小脑颗粒神经元在 80 赫兹、持续 10 秒的刺激条件下，使用 10 微摩尔 FM 1 43 进行标记。这是一张显示被 FM 1 43 标记的神经末梢的图像。同一图像中标注了 90 个编号的感兴趣区域，这些区域是在识别出活跃的神经末梢后选定用于分析的，这些图像展示了在选定时间点的神经末梢情况。

这些图像以伪彩色显示，以说明不同突触囊泡池耗竭时荧光信号的变化。最后，此处展示了这90个神经末梢归一化的荧光单位。在S1相和S2相中，可测量并比较每次连续刺激引起的荧光下降程度。

在此对照实验中，S1 和 S2 均导致了相同大小的易释放池和储备池。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用活体荧光成像技术，定量分析中枢神经末梢中特定突触囊泡池的补充与动员过程。在实施该实验操作时，重要的是需牢记：在改变 S2 实验条件之前，应首先进行 S1 对照实验，以确认细胞的存活率和反应性。