不稳定多蛋白复合物的分离 体内 可控细胞交联与免疫磁珠亲和层析

进行交联后免疫沉淀实验时，将密度为80%至90%的细胞与一毫摩尔冰上预冷的DSP（溶于PBS中，不含钙、镁或DMSO）共同孵育。

溶剂对照。DSP 是一种同双功能、可穿透膜且可还原的交联剂，能够交联彼此间距离在 12 埃以内的游离基团。交联反应完成后，裂解细胞，并使用标准对照进行免疫沉淀。

然后通过还原性SDS-PAGE分离蛋白质复合物，还原剂可裂解DSP，从而通过免疫印迹鉴定单个蛋白质。大家好，我是来自埃默里大学细胞生物学系Victor Fonde博士实验室的Stephanie Ick。我是Pearl Ryder，也来自Fonde实验室。

今天我们将向您展示一种通过可控交联结合免疫磁性亲和层析来分离 myprotein 复合物的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究短暂且不稳定的蛋白质相互作用。现在让我们开始吧。

首先标记细胞培养板底部，以标明细胞类型和具体实验条件。此处的阳性符号表示使用DSP处理，并包含仅含DMSO的阴性载体对照。向培养板中加入培养基，以准备进行细胞接种。

以1:5的比例接种HEK细胞，以便从标准管反应中分离出500微克蛋白质。单次反应管可能足以通过质谱分析后的免疫印迹鉴定目标蛋白的潜在结合伴侣。将标准反应数量至少增加10倍。

同时准备交联实验中使用的大多数溶液的母液。这些溶液包括添加了0.1毫摩尔氯化钙和1毫摩尔氯化镁的磷酸盐缓冲液，称为PBS钙镁溶液。钙离子和镁离子的添加对于细胞黏附至培养板至关重要。

实验过程中，将溶液置于 4 °C 保存。其他储备液包括交联终止液、50 X 完全蛋白酶抑制剂混合物，需每 20 分钟涡旋振荡一次，直至沉淀完全溶解。20% Triton X-100 应在 4 °C 保存，且使用期限不得超过一个月，以及 10 x 和 1 x Buffer A 溶液。

按照随附的书面实验方案中的详细说明配制并储存所有溶液。最后，配制裂解缓冲液，其成分为一倍浓度的X缓冲液，另含0.5% TRITON X-100，以及免疫磁珠沉淀缓冲液（即IP缓冲液），其成分为一倍浓度的X缓冲液。

接种后两天，加入0.1% TRITON X-101，此时细胞融合度达到80%至90%，是交联的最佳状态。在高融合度条件下，细胞容易相互堆叠，导致细胞可渗透交联剂难以充分接触所有细胞。将培养板放回培养箱中，待进行交联前取出。

在将 DSP 交联剂溶液施加到细胞之前立即配制。DSP 具有高度疏水性，因此先将其溶解于 DMSO 中，配制成 100 毫摩尔浓度的储存液，再稀释至 PBS 钙镁缓冲液中。为进一步促进 DSP 在 PBS 钙镁缓冲液中的稀释，可将适量缓冲液预热后，加入 10 微升 DSP 的 DMSO 储存液。

每1毫升温热的含钙镁PBS，逐滴加入D-S-P-D-M-S-O储备液，边加边反复混匀，直至D-S-P完全溶解。同时，每1毫升含钙镁PBS中准备10微升DMSO作为溶剂对照溶液。D-S-P稀释后，将所有含钙镁PBS溶液置于冰水浴中，放置时间不超过10分钟。

接下来，准备一个冰水浴，用于放置实验中使用的所有培养板。将含有细胞的培养板从37摄氏度的培养箱中取出，立即放入冰水浴中。用预冷的含钙镁PBS缓冲液洗涤细胞两次，每次使用的体积与之前用于交联剂孵育的体积相同；对于6孔板，每孔计算使用2毫升，依此类推。

第二次洗涤后，向细胞中加入对照溶剂（即溶于缓冲液中的DMSO）或DSP交联缓冲液溶液，置于冰上孵育两小时，并每隔约20分钟检查一次，确保所有细胞均被溶液覆盖。若部分细胞暴露，可轻柔倾斜并旋转培养皿，使溶液重新均匀覆盖细胞。少量DSP析出沉淀属于正常现象。

在细胞孵育的两小时内，在两小时孵育结束前，通过将DSP溶解于含钙镁的PBS中，配制一份1倍浓度的DSP淬灭溶液。将该溶液置于冰上保存，待用以终止交联反应，使未反应的DSP失活。当两小时孵育结束后，从细胞中移除对照溶剂和交联溶液。

加入冰冻的DSP淬灭溶液，在冰上孵育15分钟。同时，将完全蛋白酶抑制剂混合物原液按1:50稀释至细胞裂解缓冲液中。15分钟后，用含钙镁的PBS缓冲液洗涤细胞两次。

然后向细胞中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，4摄氏度下轻轻摇动30分钟。细胞裂解30分钟后，使用细胞刮刀从培养板上收集细胞。务必保持裂解物处于冰上，以尽量减少蛋白酶活性。

将细胞裂解液在台式小型离心机中以15,000 × g的最大转速、4摄氏度离心15分钟。用移液器将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。使用Bradford法测定蛋白质浓度，并开始进行免疫沉淀实验。在开始进行两小时交联反应的同时，立即着手准备免疫沉淀实验，交联反应需在带螺口盖的微量离心管中进行。

将30微升抗IgG免疫磁珠与500微升IP缓冲液混合。加入针对目标抗原的抗体。每种特定抗原所需的抗体用量应根据实际情况确定。

在初步实验中，可用于微珠的阴性对照包括：不加抗体、仅使用微珠以及使用同型对照抗体包被的微珠，以将免疫沉淀抗体结合到磁珠上。室温下在翻转摇床中孵育两小时。孵育结束后，短暂离心试管，然后将其放入磁力架中。微珠将集中在磁铁一侧的管壁上。

移除含有未结合抗体的溶液，并立即洗涤磁珠，以防止其干燥。经过两次洗涤后，向相应的离心管中加入 500 微升浓度为每毫升 1 微克的 DSP 阴性或 DSP 阳性细胞裂解液。此时可通过在裂解液-磁珠混合物中加入免疫原性多肽（浓度依据预实验确定）来制备多肽竞争性阴性对照。

在此阶段制备的另一种可能的阴性对照是仅加入500微升裂解缓冲液而不含裂解物的反应体系。轻轻重悬实验组和对照组反应中的磁珠。切勿涡旋振荡，以免导致磁珠破裂；于4°C条件下以端对端旋转方式孵育两小时。

两小时后，使用磁力架去除裂解液。短暂离心后，用一毫升免疫沉淀缓冲液洗涤磁珠，共洗涤六次，每次在四摄氏度下孵育五分钟。

为了洗脱结合的复合物，向IP管中紧邻磁珠沉淀上方加入一倍体积的上样缓冲液。轻轻敲击管底，使所有磁珠重新悬浮于上样缓冲液中，从而将磁珠聚集于管底。或者，进行免疫亲和分离时，在30微升缓冲液中加入免疫原性肽段后与磁珠孵育。

免疫原性肽所需浓度需通过实验确定。在测试10至200微摩尔的浓度范围后，将磁珠在4摄氏度孵育两小时，每30分钟轻弹试管一次。使用磁力架收集含有洗脱复合物的30微升液体，转移至洁净离心管中，用免疫沉淀缓冲液洗涤磁珠，并保存磁珠。

两种洗脱方法均需向珠子中加入一倍体积的上样缓冲液。将重悬于上样缓冲液中的免疫磁珠在75°C加热5分钟，除了使蛋白质变性外，此步骤还可裂解DSP分子，从而在后续电泳中分离复合物中的各个蛋白质。

用于 Western 印迹的 SDS-PAGE 凝胶上的样品。免疫磁珠在离心后可被排斥，并在上样前用磁力架从样品中去除。如果通过 SDS-PAGE 蛋白染色或免疫印迹检测，免疫亲和 EUA 均无 IgG 污染，则适用于质谱分析。

以下是交联和非交联细胞裂解液样品经单克隆抗体针对AP三联亚基进行免疫磁珠沉淀后，进行Western印迹分析的示例。交联步骤使得在免疫磁珠分离过程中能够检测到非交联样品中无法观察到的相互作用蛋白。阴性对照显示，无论在非交联还是交联样品中，使用无抗体对照以及与抗体同型匹配的对照（使用靶向转铁蛋白受体的IgG），均未出现特异性蛋白富集。

在此示例中，采用亲和肽洗脱法回收与免疫沉淀抗体结合的蛋白质。请注意，在肽洗脱过程中，免疫抗体在上清组分中缺失，而保留在磁珠组分中。我们刚刚向您展示了如何使用化学交联剂 DSP 结合免疫磁珠亲和纯化方法来分离不稳定的 MultiPro 复合物。

进行此操作时，保持细胞、溶液和裂解物处于低温状态非常重要，以维持交联过程中的不稳定相互作用，并尽量减少蛋白酶活性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。