利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

本实验的总体目标是利用生物膜干涉技术，在不同 pH 环境下观察蛋白质复合物的动态组装过程，并通过电子显微镜和质谱技术确认其组分。识别并理解调控蛋白质复合物形成与组装的特异性，是生物化学研究人员高度关注的问题。我们今天所讨论的方法学使研究人员能够组装、可视化并验证预测的大型分子复合物。

生物传感器表面的复杂特性使得研究人员能够轻松地将组装好的复合物释放到微小体积中，用于电子显微镜和质谱分析。在本演示中，我们追踪了炭疽毒素复合物在pH诱导下的结构重排动力学过程，并通过电子显微镜和质谱方法验证了这些重排，整个过程避免了聚集现象的发生。本次展示将由本实验室的研究生Alexandra Machen和Pierce O'Neil完成，内容包括在BLI生物传感器表面进行炭疽毒素组装、宏量样品释放以及电镜负染色操作。

Dr.Antonio Artigues 在使用 Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪分析和鉴定 BLI 释放的微样品方面发挥了关键作用。首先，将一种胺反应性第二代 BLI 生物传感器探针浸入 250 µL 水中进行水合，并孵育 10 分钟。在 Blitz 软件中，按照下表列出的时间参数设置步骤时间。

通过将生物传感器尖端浸入250 µL水中30秒，测量生物传感器厚度和密度的初始基线，从而启动BLI运行。接下来，将尖端浸入250 mL含50 mM NHS和200 mM EDC的溶液中7分钟，以活化生物传感器。然后，将活化的生物传感器浸入溶于0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）的50 mM PDEA溶液中5分钟，以生成活化的生物反应表面。

现在，将活化的生物反应性生物传感器浸入含有100纳摩尔E126C LFn的250微升溶液中，该溶液由10毫摩尔醋酸钠（pH 5）和100毫摩尔氯化钠缓冲液组成，浸泡5分钟。将LFn探针浸入50毫摩尔L-半胱氨酸、1摩尔氯化钠、0.1摩尔醋酸钠（pH 5）溶液中4分钟，以淬灭任何剩余的游离巯基反应性基团。将淬灭后的LFn探针浸入50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中，建立缓冲液基线，随后将探针浸入0.5微摩尔保护性抗原前孔（protective antigen prepore）、50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中5分钟，以形成LFn-PA前孔复合物。

一旦PA前孔结合完成，将探针从PA前孔溶液中取出，并浸入50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中30秒，以洗去非特异性结合的PA前孔。将LFn-PA前孔复合物浸入含有0.5微摩尔CMG2的50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中，孵育5分钟。再将LFn-PA前孔-CMG2复合物浸入50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中30秒，以洗去未结合的CMG2，形成早期内体前体复合物。

进行电镜分析时，将生物传感器探针浸入含有5 µL 50 mM DTT、50 mM Tris和50 mM氯化钠的PCR管中，以从生物传感器探针上释放LFn PA-前孔 CMG2复合物。为进行该复合物肽段的串联质谱分析，将生物传感器浸入含有5 µL 50 mM DTT、6 M无角蛋白的盐酸胍和25 mM碳酸氢铵（pH 8）的PCR管中，以从生物传感器探针上释放LFn PA-前孔 CMG2复合物。为观察pH转变后的复合物，按照上述方法在生物传感器上组装LFn PA-前孔 CMG2复合物。

将生物传感器尖端浸入5 mM乙酸盐缓冲液（pH 5）中5分钟，以启动PA-prepore向PA-pore的构象转变。该转变表现为电流信号振幅先升高，随后出现较大程度的下降，推测此下降与受体完全解离相关，原因是结合亲和力降低。用于电镜分析时，将生物传感器尖端浸入含有1.25 mM胶束的溶液中5分钟，以防止二硫键释放后在溶液中发生聚集。

进行负染透射电镜观察时，首先在0.38毫巴稳定气压和-15毫安条件下对覆有碳膜的铜网（300目）进行辉光放电处理20秒，随后向腔体内通入空气卸真空。用一对洁净镊子夹住铜网。然后吸取4 µL释放的复合物样品滴加到铜网上，静置吸附60秒。

用滤纸楔形片将残留液体吸走。然后用移液器将5微升0.75%、0.02微米过滤的甲酸铀酰溶液滴加到载网上进行染色，5秒后用滤纸吸去多余的染色液。将载网覆盖后在室温下晾干。

然后使用透射电子显微镜观察样品。最后，根据文本方案制备质谱样品后，在自动控制下使用 CID 模式和 35 的归一化碰撞能量操作质谱仪，持续进行一次 MS 扫描，随后在三秒内尽可能多地完成串联 MS-MS 扫描。BLI 传感图曲线是由于炭疽毒素组分的特异性结合所引起的振幅变化的实时读数。

第一个上升阶段是LFn结合到针尖上。在淬灭并建立基线后，PA前孔与LFn结合，随后加入可溶性CMG2，形成组装好的早期内体前体复合物。该复合物随后暴露于低pH环境，导致受体结合减弱，并促使前孔转变为伸展的孔构象，这一转变可通过加入胶束得以确认。

此处展示的是复合物从生物传感器释放后获得的负染电镜图像。早期内体样品网格显示存在与完整的三元复合物（LFn-PA前孔-CMG2）一致的密度。酸化后复合物网格显示PA已转变为孔结构，并通过胶束包埋而溶解，未见明显的CMG2密度。

质谱分析（MS）证实了蛋白质复合物的存在，早期内体前质谱样本中检测到三种毒素组分的肽段，LFn、PA 和 CMG2 的覆盖率分别为 60.46%、67.97% 和 54.15%。晚期内体样本中仅检测到 LFn 和 PA 的肽段。CMG2 的缺失与生物膜层干涉（BLI）技术中观察到的纳米级尺寸减小现象一致，该现象发生在孔道形成过程中。能够监测并验证大分子复合物的组装过程，是深入理解大型生物大分子复合体特异性和功能性的关键步骤。

将预先组装的生物大分子复合物从生物传感器释放到微体积中以用于电子显微镜观察，这一能力将对结构分析极为有益。我们对生物传感器组装复合物成分的分析仅使用了0.04飞摩尔的释放复合物，即可在内体酸化前后鉴定其组分。该生物传感器组装释放方案可进一步应用于追踪其他细菌毒素或病毒蛋白结构中天然但难以捕捉的pH诱导内体转化过程，同时还能避免蛋白质聚集。