记录多细胞行为 Myxococcus xanthus 使用延时显微电影技术研究生物膜

以下实验的总体目标是建立一种低成本的时间推移显微电影分析方法，具有足够的严谨性以产生可重复且可量化的结果。该方法通过使用廉价且可重复使用的硅胶垫圈来构建琼脂培养基平板或显微镜载玻片而实现。实验结果表明，这些平板复合体在多种培养基类型和琼脂浓度条件下，能够保持水分和充分的氧气供应超过一周时间。

此外，由于延时显微摄影是一个耗时较长的过程，使用八台价格较低的显微镜有助于加快数据采集速度。大家好，我是来自雪城大学生物学系Roy Welch博士实验室的Ryan Taylor。今天我们将向大家展示在本实验室中制作细菌生物膜延时影像的实验流程，并将利用该方法研究MTIs生物膜的多细胞行为。

那么，让我们开始吧。首先，使用分光光度计测量过夜培养的恶臭假单胞菌（Occus sanus）培养物的细胞密度，取1毫升培养物转移至2.5毫升离心管中，离心形成菌体沉淀，用TPM培养基洗涤并重悬细菌，具体操作详见随附的书面实验方案。使用移液器吹打并涡旋振荡，以彻底重悬菌体沉淀，此过程可能需要一定时间。接下来，向50毫升TPM（即检测用培养基）中加入0.5克阿拉伯糖（aros）。

同时将0.5克aros加入50毫升C-T-T-Y-E中，C-T-T-Y-E为营养琼脂培养基，需经高压灭菌。然后将培养基置于培养箱或水浴中，保持55摄氏度。在构建追踪实验时进行上述操作。

将平板复合物置于营养盘上，先用火焰灭菌玻璃显微镜。在载玻片上放置一个无菌的、厚度为0.5毫米的硅橡胶垫圈。用移液器吸取约300微升CTT YE培养基，加入由垫圈在载玻片上形成的孔中。

将C-T-T-Y-E培养基琼脂堆成小丘状，火焰灭菌另一张载玻片，并将其倾斜地放置在C-T-T-Y-E培养基琼脂上。倾斜放置载玻片可防止气泡形成。载玻片就位后，用小型 binder 夹在两侧夹紧固定。

将剪切好的复合物置于 4°C 环境中，使 C-T-T-Y-E 培养基琼脂凝固，通常需要约五分钟。琼脂凝固后，即可准备追踪实验中所用的平板复合物。

首先准备用于构建检测复合物的载玻片。每个复合物使用两片玻璃显微镜载玻片，并用火焰灭菌。将一个高压灭菌垫圈置于其中一片载玻片上，作为检测装置的底部。

另一张载玻片用于压平琼脂糖并作为支撑载玻片。检测装置的顶部为盖玻片。首先用标签胶带包裹一张显微镜载玻片，然后对玻璃盖玻片进行火焰灭菌，并将其放置在已灭菌的包裹载玻片上方。

向上推动包裹的载玻片支架，使盖玻片保持稳定，防止其破裂。用镊子将高压灭菌垫圈放置在经火焰灭菌的盖玻片顶部。按压底部载玻片和盖玻片上的垫圈，确保它们与玻璃之间形成密封。

否则，培养基阵列可能会干涸。将载玻片垫圈和盖玻片垫圈组件放置一旁，灭菌面朝上，此后每次仅操作一个复合体，以防止培养基琼脂凝固，否则将导致成像质量下降。首先放置营养盘。

从4摄氏度中取出营养盘复合物。移除封闭夹具，然后用带有100微升玻璃一次性吸头的微型取样移液器，将载玻片分开，暴露已凝固的C-T-T-Y-E琼脂。同时，从C-T-T-Y-E培养基琼脂中取出一个直径为1毫米的营养盘，并将其放入盖玻片密封垫圈所形成的孔中。

然后从培养箱中取出TPM培养基琼脂，用移液器将300微升加入盖玻片上的密封圈所形成的孔中，孔内含有营养盘。TPM培养基琼脂应堆叠至使T-P-M-S-A培养基琼脂表面变平。取一片经火焰灭菌且无密封圈的载玻片，以一定倾斜角度放置在TPM培养基琼脂上方。倾斜放置载玻片有助于防止气泡形成。

使用小型活页夹在复合物两侧各夹一个，将其固定在一起。将夹好的复合物置于 4 摄氏度环境中，静置使培养基凝固。此过程通常需要约五分钟。

待培养基凝固后，将复合物从4°C取出。取下长尾夹，并挤压复合物末端。为松开缠绕胶带的载玻片，需取下胶带缠绕的载玻片，并将其放置于实验台上以备后续使用。

然后使用一对镊子作为楔子，将盖玻片-垫圈-培养基琼脂复合物从载玻片上分离，并丢弃载玻片。分离盖玻片-垫圈复合物时，不得使用撬动动作，以免导致盖玻片破裂或培养基琼脂粘附在载玻片上。

取下支撑载玻片后，将盖玻片-垫圈-培养基琼脂复合物放置到用胶带包裹的载玻片上，垫圈面朝上。将此复合物置于燃烧器旁，使新暴露的培养基琼脂表面所有可见水分蒸发。切勿让培养基琼脂干燥超过一分钟。

由于这可能影响 M Zant 的群集行为，请将细胞接种到新制备的检测复合物上。待盖玻片垫圈培养基琼脂复合物中的多余水分蒸发后，吸取0.5 µL浓缩细胞并接种至培养基上。在接近培养基琼脂复合物时，应先按压移液器尖端以排出气溶胶。

在移液器吸头底部出现一滴细胞液，便于将细胞滴加到培养基表面时避免吸头接触琼脂。琼脂表面的凹陷可能改变菌群的迁移行为。将移液器垂直向下移动，将细胞滴加在距离嵌入的营养片约一毫米的位置。

然后将移液器垂直向上拔出。通过这种方式，可确保菌群呈圆形。细胞接种后，将培养皿置于火焰旁，使细胞液滴干燥，时间不超过20秒。

干燥后，将形成复合物底部的载玻片垫圈组件与盖片上的垫圈对齐。插入形成复合物顶部的垫圈培养基跨细胞复合物。轻轻按压使其紧密结合。

使用无尘纸擦拭载玻片和盖玻片表面，去除任何残留物，以防止产生冷凝。清洁载玻片后，立即将载玻片组件放置于加热的显微镜载物台上，载玻片朝下，盖玻片朝上。若已形成冷凝，需将载玻片组件在加热载物台上静置数秒，然后再启动图像采集软件。

为准备拍摄视频，请在显微镜上选择合适的物镜，如 2×、4× 或 10×。打开相机和显微镜，并检查光照强度，确保光线不过强。启动计算机并打开图像采集程序。

单击实时图像窗口并调节显微镜焦距。图像将显示为如下所示的形态。开始采集图像。

在开始的1小时内，务必定期检查焦距，因为培养基琼脂容易沉降，导致焦距漂移。图像采集完成后，将获取的图像转移用于存储。通过在90%乙醇中浸泡过夜或使用TOLA处理垫圈，以拆解载玻片组件并实现垫圈的重复使用。

该延时录像展示了采用本文所述追踪实验处理的 em。拍摄条件为每分钟采集一帧图像，放大倍数为 20 倍，播放速率为每秒 60 帧。该延时录像展示了一群 eant 细胞，其中 1% 的细胞表达 GFP。

该视频通过合并交替的相差图像和荧光图像生成。实验在1% Aros的C-T-T-Y-E上进行，捕获速率为每分钟一张图像，放大倍数为100倍。此延时视频展示了M Anthes的滑行运动。

该实验在含有1% Aros的C-T-T-Y-E培养基上进行，采集速率为每分钟一张图像，放大倍数为100倍。此时间延时视频展示了POSA的抽搐运动。该实验在含有1% Aros的LB培养基上进行，采集速率为每分钟一张图像。

放大倍数为20倍时，播放速率为每秒60帧。该延时录像显示了Smar感知的群集运动能力。该实验在LB培养基和1%琼脂上进行，采集速率为每分钟1帧。

放大倍数为20倍时，播放速率为每秒60帧。该延时录像显示了EGT的滑动运动。该实验在LB培养基中进行，琼脂浓度为0.5%，图像采集速率为每分钟1帧；由于0.5%琼脂在lv中较为脆弱，因此以20倍放大倍数播放时，播放速率设为每秒120帧。

本实验采用图一B中所示的较大垫圈。我们刚刚向您展示了如何生成细菌生物膜的时间推移电影。进行此操作时，重要的是要记住务必耐心细致，尽可能精确，以获得一致的结果。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。