使用延时视频显微镜对细胞随机迁移进行定量分析

以下实验的总体目标是利用延时视频显微镜实时定量测量细胞迁移。首先，用胶原蛋白包被六孔培养板，然后将目标细胞稀疏地接种到包被好的培养板上。第二步，使用移液器枪头在培养板上制造一个划痕，确保留出足够的空间供细胞迁移。

接下来，使用温度控制系统设置显微镜，并以固定时间间隔采集图像，以实现实时连续监测迁移中的细胞。最终，采用颗粒追踪方案来评估实验组与对照组细胞在平均速度和总位移上的差异。该技术相较于现有方法（如避让室迁移实验）的主要优势在于，它不依赖于终点定量迁移测量。

相反，该方法能够连续监测和计算不同的参数。此方法有助于回答肿瘤生物学领域的关键问题，例如特定基因或药物如何影响肿瘤细胞的迁移？在实验前两天，向六孔培养板的每孔中加入1.5毫升用Opti培养基稀释的胶原蛋白，然后在实验前一天于4°C条件下过夜孵育。

将目标细胞用每孔2毫升含FBS的DMEM重悬，转移至包被有胶原蛋白ENC的培养板各孔中，在37摄氏度孵育过夜。在实验当天，使用移液器枪头在过夜培养的细胞上制造划痕，并用PBS洗涤每孔，以去除因划痕产生的碎片。

向洗涤后的孔中加入含FBS的DMEM培养基，然后在显微镜下观察，确认已形成清晰的划痕区域。打开显微镜相机和活细胞成像装置后，将培养板置于显微镜载物台上。用新的活细胞环境控制腔室覆盖培养板，并将温度设定为37摄氏度，二氧化碳浓度设定为5%。现在，在菜单栏中打开SlideBook软件。

单击圆形内的 F 按钮以选择对焦控制。在物镜设置框中，使用下拉窗口定义物镜。在滤光片组设置框中，选择将光路导向 I 片的设置。选择适用于明场照明的滤光片，然后单击打开明场照明。

打开明场快门。然后在物镜转换器上选择明场滤光片，通过目镜观察样品，找到合适的视野并将样品调至清晰。接着转动滤光片转盘，将光路切换至相机。在幻灯片成像软件中进行图像采集时，单击焦点控制，选择XY以通过目镜选取不同位置，然后单击设置点以锁定每个位置。

进行图像采集时，手动微调屏幕上显示的相机图像焦距，然后使用焦距控制窗口中的工具调节载物台的 Z 轴位置。为获得最佳效果，应以细胞贴近培养板处的平坦突起结构作为对焦参考，以辅助对焦。使用滑块调节曝光时间，使其处于适合对焦的合理范围内。

如果已选择多个XY位置，请通过选择焦点控制，然后选择xy，再选择访问点，来为每个单独位置调整焦点。在幻灯片库中，从菜单栏选择相机图标，选择拍摄类型，然后选择延时拍摄以设定实验的持续时间。

从下拉菜单中输入一个时间点开始与下一个时间点开始之间所需的延迟时间。在间隔字段中，第三个字段将根据手动输入的数值自动计算。在多点 XY 采集下，若实验包含多个 XY 位置，请选择多点列表。

最后，为文件命名以保存文件，进入捕获控制并选择高级，然后进行卷绕。每次时间点结束后，先捕获到内存，再保存为卷绕文件。开始时点击图像。

在幻灯书菜单栏中，从下拉菜单中选择“导入”，然后单击幻灯书卷轴。选择从迁移实验中生成的针对不同视野和时间点的所需幻灯书文件。打开第一个文件后，在菜单栏中选择“掩膜”，然后从下拉菜单中选择粒子追踪协议。

在粒子追踪菜单下，选择手动粒子追踪方案。将出现一个包含起始和结束时间点的窗口。为分析随机迁移，选择掩膜，然后选择粒子追踪方案。同样，为确定物体中心的坐标，选择面积中心。

然后点击“跟踪”并继续。现在为每条路径选择所需的统计参数，例如位移和平均速度。如图所示，点击“计算”以查看统计结果。

本框图展示了以速度为量化指标的随机迁移分析示例。在本实验的须状图中，敲低了肿瘤抑制基因的 M-D-A-M-B 2 31 细胞平均速度有所增加。与此处的对照组 M-D-A-M-B 2 31 细胞相比，来自第一幅图的细胞随机迁移通过细胞位移进行了分析。

同样，与对照组 MDA-MB-231 细胞相比，总肿瘤抑制基因敲低组的细胞位移增加。该延时视频显微镜录像中的对照组 MDA-MB-231 细胞在胶原上贴壁培养过夜，随后在随机迁移过程中每小时采集一次图像，共持续 18 小时。

注意观察细胞随时间推移逐渐离开其原始位置的情况。本视频记录并分析了测试用 M-D-A-M-B 231 细胞在胶原蛋白上过夜接种后的迁移情况。请注意，与前一个视频中的对照细胞相比，这些测试细胞具有更强的迁移能力。

采用此方法后，还可进行细胞侵袭和dynas等其他实验，以回答更多问题，例如：细胞在癌症转移的发生发展过程中发挥哪些作用？该技术为细胞生物学领域的研究人员利用分离的癌细胞系探索细胞迁移提供了重要基础。