荧光活细胞成像技术对生长缓慢的社会性细菌 Myxococcus xanthus 完整营养细胞周期的观察

该方法有助于解答细菌细胞生物学领域的一些关键问题，例如细胞如何复制其DNA、如何生长以及如何分裂。该技术的主要优势在于，可在显微镜下连续观察活体细菌细胞至少24小时，且该技术无需特殊设备。尽管该方法可用于研究黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）的生长与分裂过程，但同样可轻松应用于其他生长缓慢的细菌。

首先，在无菌离心管中用500微升含抗生素的1%CTT培养基重悬一个M.xanthus菌落，并将整个悬液转移至含有5毫升1%CTT培养基的50毫升锥形瓶中。通过将1克琼脂糖与80毫升TPM缓冲液和20毫升1%CTT培养基混合，配制含有0.2%CTT的1%琼脂糖显微镜观察溶液。将该溶液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全融化。

将约 60 毫升熔化的琼脂糖倒入培养皿中，静置冷却至室温。使用前，将琼脂糖垫在 32 摄氏度下预热至少 15 分钟。接着，将无菌玻璃盖玻片放置在中间带有孔洞的塑料或金属支架上，然后用胶带将盖玻片固定在支架上。

将10至20微升指数生长期的M.xanthus细胞加入盖玻片上。如需添加荧光微球作为细胞的定位标记，可用TPM缓冲液将微球稀释至1:100。充分振荡混匀微球悬浮液，然后取5至10微升加入细胞中。

从预先加热的大块1%琼脂糖垫中，切下一小块约与盖玻片大小相当的琼脂糖垫，将其放置在细胞上方。然后将盖玻片盖在琼脂糖垫上，以防止蒸发并保持细胞处于湿润环境中。将显微镜样品在32°C下孵育15至20分钟，使细胞附着于琼脂糖垫底部，随后进行延时显微成像记录。

为了进行延时显微成像，打开显微镜并启动显微镜控制软件。选择正确的物镜以及相应的反射镜和滤光片，以获取相差图像以及绿色荧光、红色荧光或黄色荧光蛋白的图像。在物镜镜头上滴加一滴高质量的浸油，并将预热至32摄氏度的样品底部也滴加浸油。

将带有样本的金属框放置在显微镜载物台上，使孔的一面朝向物镜，然后用载物台夹具牢固固定样本。通过沿Z方向移动载物台使其靠近物镜，从而对细胞进行聚焦。当物镜和样本上的油接触时，沿X/Y方向移动载物台。

切换到 Metamorph 软件并打开采集工具。在“设置”下拉列表中选择“相差显微”模式，并将曝光时间设置为 100 毫秒。点击“显示实时图像”，将细胞移至焦平面，并在 X/Y 方向上移动载物台，直至视野中可见多个单个细胞。

确保视野区域内至少有一个荧光微球，以便后续对采集的图像进行对齐。接着，打开显微镜控制软件中的多维采集向导，设置延时实验，使显微镜能够根据需要在多个波长和载物台位置采集图像。在主选项卡中，启用延时和多波长功能。

窗口左侧将出现其他选项卡。单击“保存”选项卡，然后选择“选择目录”，以选定计算机硬盘上的一个空文件夹来保存采集的图像；接着启用“若文件存在则递增基础名称”，以确保连续的数据集不会覆盖先前的数据。为实验命名，名称中应包含日期以及菌株名称或实验标题。

单击延时摄影选项卡以调整延时参数，然后将时间间隔设置为20分钟，将持续时间设置为24小时。时间点的数量将自动更新。现在，单击波长选项卡。

通过更改数字来选择在每个时间点为每幅图像采集的波长数量。选择“允许每个波长单独记忆硬件自动对焦位置”。点击顶部的“第一波长”选项卡。

在“照明”下拉列表中，选择“相差”。将曝光时间设为 100 毫秒，在“采集”下拉列表中选择“每个时间点”。在下拉列表中选择“从不”，以关闭自动曝光；在自动对焦的下拉列表中选择“每次采集”。

使用以下参数设置每个波长的曝光，方法如前所述。然后，为了从多个载物台位置获取图像，在“主”选项卡中启用“多位置载物台”。单击“载物台”选项卡，再单击“实时”按钮以查看视野。

移动载物台的 X/Y 方向，直到目标区域进入视野。在“载物台”选项卡中点击加号保存 X 和 Y 坐标。再次移动载物台的 X/Y 方向，直至找到新的目标区域，并通过点击加号再次保存坐标。

继续操作直至保存所需数量的区域。通过点击已保存的不同X和Y位置，再次检查细胞是否处于焦点，并点击AFC保持以启动硬件自动对焦，从而在实验过程中保持保存的Z位置恒定。在显微镜控制软件的多维采集向导中，单击“采集”以开始延时记录。

在时间序列记录的前几个时间点后，检查细胞是否仍处于焦点中，以最大限度地提高图像质量，并在需要时重新对焦。为了生成时间序列视频并进行图像对齐，请启动图像分析和处理软件。通过点击“Review Multi-Dimensional Data”、“Select Base File”、“Select Directory”，然后打开包含多维数据的文件夹，将图像作为堆栈打开。

检查数据集并点击“查看”。数据集将从第一个时间点开始直至结束，以单张图像形式显示。激活用于创建图像栈的波长，然后选择所有需要包含在图像栈中的图像，点击“加载图像”。

对所有波长重复此步骤，并保存完成的图像栈。激活需要进行漂移校正的图像栈。通过“应用程序”中的“自动对齐”工具打开对齐功能。

选择“Stack”作为图像来源，并选择“First Plane/Time Point”作为参考平面，然后通过“Source Stack”按钮选择堆栈，点击“Apply”。自动对齐完成后，保存对齐后的堆栈。若要以 MOV 或 AVI 格式生成视频，请通过“Stack”菜单中的“Make Movie”功能打开相应选项。

使用“Source Stack”按钮选择延时录像，然后选择输出格式、帧率、帧数，然后点击保存。在此项针对运动型DK1622野生型细胞的延时实验中，每隔五分钟采集一次相差图像，持续24小时。结果显示，细胞具有运动能力，且主要以群体形式移动。

在使用非运动性 Delta-mgIA 细胞进行相差活细胞成像时，观察了单个细胞在微菌落形成过程中的生长与分裂。当每五分钟采集一次图像并持续 24 小时，可在单细胞分辨率下定量得出细胞分裂间隔时间为 235 ± 50 分钟。为了探究在长时间追踪 YFP 标记蛋白时细胞是否正常生长，对表达 ParB-YFP 的橙色粘球菌（M.xanthus）细胞进行了追踪。

ParB-YFP 最初在细胞亚极区形成单个簇状结构。在细胞分裂前或分裂后不久，该簇状结构发生复制，其中一个保留在旧的细胞极，另一个则易位至新的细胞极。在本实验中，表达 FtsZ-gfp 的非运动性细胞在细胞中部显示出 FtsZ-gfp 的强烈聚集，该聚集位置决定了细胞分裂的位点。

FtsZ-gfp 在细胞中部形成簇，主要出现在较长的细胞中。细胞分裂两小时后，FtsZ-gfp 在子代细胞的细胞中部聚集。一旦掌握该技术，便可常规应用于黄色粘球菌以及其他任何生长缓慢的细菌。

在为某种细菌建立该实验流程时，重要的是调整琼脂平板中培养基的成分，以满足该细菌特定的生长需求。对于任何细菌，都需确定最佳成像条件，例如曝光时间、光照强度和成像频率，以避免光毒性。此外，对于任何荧光标记的蛋白质，还需调整成像条件，以避免光毒性和光漂白。